病毒学方法技术的进展

摘 要从早期的结晶提纯到今天的分子细胞水平的病毒学研究,病毒学的研究随着时间而不断发展,而病毒学发展的重要依据就是相关技术方法的不断进步.本文从病毒的鉴定检测方法、病毒的分离与培养方法、病毒的功能机制研究方法这三个方面总结现在病毒学研究的常用方法,为通用的技术方法提供参考依据,以推动病毒研究的技术改革与创新,为今后的研究工作奠定良好的基础.

关 键 词病毒学方法分子细胞水平

中图分类号：G644文献标识码：A

相对动物学或者植物学这些传统学科,病毒学是一门始创于20世纪40年代的新兴学科.虽然在此之前,就有发现能通过细菌过滤器的烟草花叶病致病因子的科学家D.Ivanofsky,以及发现具有滤过性的口蹄疫病原的科学家Loeffler和Frosch,但是基于历史条件和知识水平的限制,人们或许观察到了病毒引起的自然现象,却无法对其产出真正科学的认识.

病毒学的里程碑事件应属1935年美国科学家Stanley对于烟草花叶病毒的提纯,使人们不再空泛地想象病毒的存在,而是真切地观察和接触到病毒,为今后的研究开辟了广阔的道路.随后,观察手段,培养方法,以及相关的病理性研究手段的不断提升,也使得病毒学这样一门起步较晚的学科开始了飞速发展.

回顾病毒学研究的发展历程,不难发现,学科的发展很大程度上依赖于技术的进步与革新,以及与相关学科的借鉴与学习.故了解和掌握病毒学方法技术的发展历史以及技术要求,对于学科的研究,以及技术的创新,都有诸多裨益.

1病毒鉴定检测的相关方法技术

对于病毒最直观的认识无疑是其生物学上特征,如病毒的理化性质（如病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、特外存活期等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）.目前,病毒生物学特征的研究鉴定方法主要分为三大类：显微成像技术（或相关针对病毒形态结构观察的技术）、免疫-血清学检测和分子生物学检测.

1.1病毒形态结构的观察技术

众所周知,病毒颗粒的大小远小于普通细菌,所以对病毒最直观的鉴定方法就是使用电镜观察,它可以直接地看到病毒的形态结构、存在与否.自第一台电子显微镜的诞生,这门技术已为病毒学在内的多种生物学科作出了重要的贡献,优点也十分明显,操作简便,快捷有效,所以,即使是在进入了分子研究水平的今天,电子显微镜仍然发挥着它不可替代的作用.

另外,在原始的技术基础之上加以改进也形成了一些针对特殊观察对象的电镜技术,如电镜负染技术和免疫电镜检测技术等.低温电镜技术,就是一种结合电镜技术和低温结晶观察病毒的三维结构的技术,其优点不仅在于其分辨率更高,而且对于病毒样品的损伤和失真的概率都大大减小,常用于极微量和高保真要求的病毒观察检测.

X-射线衍射技术是通过扫射病毒微晶得到的衍射图像来分析还原原始的病毒结构,但为了保证衍射图像的准确性,往往对样品的纯度和颗粒完整性要求较高,所以这种技术的使用范围相对受限.

核磁共振技术,相对于前面提到的技术,对于操作的要求更低,运用范围也更广,但是对于结构的准确性判断略低.此技术主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子构象变化的研究.

1.2免疫-血清检测方法

此类技术的原理主要根据病毒的侵染性以及其作为核蛋白的特性而设计的.运用最为广泛的还是血清学测试,即利用血清中可以和具有某种特定结构特征的病毒结合的抗体,从而进行病毒的定性定量分析.此法也广泛应用用于医学临床的诊断,操作简便,低廉有效.

酶联免疫吸附实验（ELISA）也是利用特异抗体吸附病毒颗粒的原理,只是在抗体上附带了酶标记,从而使反应可以有颜色强弱的变化,利于定时定量监测病毒浓度.此法灵敏度高,且不受浓度范围或其他抑制剂的干扰,也越来越多地应用于相关的生产实践中.

免疫组化技术也是将抗体带上特殊的显色基团,使其游离时不显色,而于抗原物质结合后显色.利用这个特点,可以检测特定组织中不同区域的病毒含量已经分布特点,利于进行组织性毒理分析.

1.3分子生物学检测方法

病毒寄生在宿主细胞内,但它又有不同于宿主细胞的特异基因组序列,特异序列的存在就说明病毒的存在,这就是分子生物学检测病毒的原理.

聚合酶链式反应（PCR）是其中最为常用的一种检测手段,其原理即利用DNA半保留复制的特点,以原始DNA为模板合成两条一样的双链,从而达到扩增量指数增长,DNA总量可检测的目的.另外,由于病毒的核酸有的是DNA,有的是RNA,所以常规的PCR以及反转录PCR即可针对不同的病毒基因进行检测.

实时定量PCR与传统PCR基本相同,只是在体系中加入荧光基团,反应中利用CCD实时读取荧光信号,检测.不仅减少的污染和浪费,也使定量快速而方便,可以实现多样品和高通量的反应.

核酸原位杂交的原理是利用生物素编辑的cDNA探针来杂交组织中的样本,从而确定病毒在宿主中的分布和载毒量.该技术,往往与免疫组化一起使用.

dsRNA技术是利用dsRNA在一定条件下与纤维素特异结合的性质,从来快速简便的提取检测出病毒颗粒中的dsRNA等,高效准确,在普通实验室和生产工厂中都有所应用.

2病毒的分离与培养的相关技术方法

2.1病毒的提纯技术

作为病毒学研究的重要技术前提,病毒的提纯质量往往影响了后续一系列的步骤,所以其重要性不言而喻.由于病毒的生长特性、理化性质和宿主都差异颇大,提纯的方法也不尽一致.

在病毒研究初期,沉淀法最常被使用,其主要利用病毒的蛋白外壳,改变溶剂性质,从而分离病毒粒子.相对而言简便快速,但也常存在粗糙易变性的缺点.

色谱法源于化学中多组分的分离,由于生物成分的多样性,也常使用该技术.色谱法主要分为吸附法、柱层析法和电泳法,都是利用较为温和的环境,以及病毒的特异吸附或凝集等特质而设计的技术.种类繁多,应用广泛.超速离心利用样品中不同成分拥有不同的沉降系数,在离心过程中,不同成分会在溶剂的特定位置形成区带,从而达到分离提纯的目的.此法常使用生物活性溶剂,且离心本身对病毒粒子损伤较小,故常用于理想的病毒快速分离技术.

2.2病毒的获取

最初的植物病毒学和动物病毒学的诸多研究都是建立在活的宿主体系上的,并且至今仍在应用,如生产不能体外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、检测疫苗的安全性等.但动物宿主体系存在太多弊病,随着细胞培养技术和分子生物学的发展,有逐渐被淘汰的趋势.

现在,病毒的获取主要是三种途径：从宿主直接获取、感染宿主扩增病毒、直接合成,其中后两种途径使用更为广泛.

感染宿主扩增病毒即要使用到组织细胞培养,这项技术本来属于细胞学的范畴,后由于动物源性或者细菌源性的病毒研究需求,此技术也越来越多地应用于病毒学的研究中.如,空斑分析最初用于测定噬菌体含量,而今也逐渐普及为动物病毒的研究中去.

直接合成法则是利用动物转基因技术,将病毒的遗传信息整合进目标动物中,在动物体内完成基因的表达,蛋白的合成,以及病毒的组装等步骤.而动物转基因技术也是现今生物领域的热点内容,技术繁多,更新迅速,也为病毒的研究提供了良好的基础.

3病毒的功能机制研究的相关技术方法

3.1病毒的遗传学的研究

关于病毒遗传学的研究和细菌等微生物的遗传学研究技术相似,如PCR等.但是病毒的遗传物质除了可能是DNA还可能是RNA,而且现在对于RNA病毒的研究居多,所以针对性的技术也与细菌等微生物的遗传学研究技术有所区别.

对于RNA病毒使用最多的是反向遗传学技术,最初即使用反转录PCR得到病毒RNA的cDNA,从而完成病毒基因组的探索工作,以达到了解或有目的性改造病毒基因组实现生产应用的目的.此法对于类型多样的病毒研究提供的最为基础的遗传学数据,为疫苗开发筛选、新型病毒载体等多方面都给予有力的技术支持.

针对病毒易变异的特点,单链构想多态性检测技术（SSCP）则理想地解决了这一问题.近年来,对于多种模式生物的基因组测序的发展,越来越多的研究开始着重于探索基因变异的问题,而SSCP技术正是这样发展起来的.其主要用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入,为病毒的分子演化规律以及流行病学提供充分的证据.

基因芯片技术的概念来源于计算机芯片,即将大量寡聚核苷酸以阵列形式有序固定于载体表面,与待测样本的病毒分子杂交,然后利用化学发光或同位素等显色方法,用CCD等仪器对杂交信号进行高效检测分析.主要用于病毒基因表达谱和基因多态性等方面的研究.

3.2病毒表达机制的研究

在病毒的表达机制研究中,主要是利用不同的检测手段,判断病毒表达的具体情况,并对于病毒表达的情况进行总结归纳,研究其时空上的机制和规律.

NorthernBlots即针对病毒RNA样品的技术手段,原理与SouthernBlots相似,利用探针与固相RNA杂交,再对探针分子的图像进行捕获和分析.此法特异性高,常用于分析已知基因的表达情况.

mRNA表达差异技术主要使用反转录PCR以及等量不同宿主的定量检测,来确定抗病种和感病种的差异表达基因,从而进一步确定造成品种差异的原因.

3.3病毒蛋白质的研究

病毒蛋白决定了病毒的形态结构,常作为抗原来激发人体内的免疫反应,作用于宿主细胞信号转导途径,导致宿主细胞内信号转导发生紊乱；并且一些病毒蛋白具有酶的作用,可作为细胞毒素作用于宿主细胞.

大范围而言,病毒蛋白质研究的技术,都隶属于蛋白质组学的研究范畴之内,只不过针对不同特性的蛋白,往往会选取最为有效而简便的技术方法进行研究.而由于蛋白质分子结构、化学生物特性等多方面差异很大的特点,其针对性技术也是五花八门,在此仅列举较为常用的技术,以供研究者学习参考.

经典的方法有亲和层析、抗体受体法、抗细胞受体法、抗独特型抗体法、病毒覆盖蛋白法.大多还是利用病毒蛋白和抗体蛋白或者其他蛋白或大分子物质的作用,来检测病毒蛋白的特性.虽然这些方法快速简便,但是由于方法本身较为粗糙,样品用量较大,准确性存疑等问题,现在仅在低要求情况下使用.

现代的方法则更加丰富,也分别具有各自的特点,常被运用于现在的病毒蛋白的研究.

噬菌体表面呈现技术是利用噬菌体本身表达的两种结构蛋白会暴露在噬菌体表面,故将外源基因倒入两个结构蛋白基因间,使外源序列一起表达,然后让表达产物与大量配体结合,筛选特殊结合性配体.但此法表达出来的蛋白可能与天然状态不符,所以使用较为受限.

免疫共沉淀是一种成熟蛋白作用技术,其原理为在溶液或细胞中,用一种蛋白的抗体耦合可与此蛋白特异结合的另一蛋白,从而形成一抗体两蛋白的沉淀,从而获取具有结合饵蛋白能力的未知蛋白,探索细胞中蛋白作用机制.

酵母双杂交技术是利用真核基因的特殊表达机制,通过将两个蛋白的编码序列整合在同一酵母细胞内的特殊转录激活域附近,若两种蛋白可以发生相互作用,则会激活相应的报告基因,从而报告蛋白的相互作用.此法常用于筛选病毒蛋白的特异膜蛋白受体.

除了以上列举的技术之外,还有cDNA文库技术、质谱分析技术、GSTPull-down技术、串联亲和纯化、荧光能量共转移等多种技术应用于蛋白互作的研究.