高效液相色谱法测定硫酸氢氯吡格雷的含量

[摘 要 ] 目的：建立硫酸氢氯吡格雷的含量测定方法.方法：采用HPLC法,色谱柱Sino Chrom ODS-BP（4.6 mm×200 mm,5 μm）,流动相：1%三乙胺（pH等于4.0）-乙腈（25∶75）,检测波长：225 nm,流速：1.0 ml/min.结果：硫酸氢氯吡格雷进样量在0.48～0.72 μg范围内呈良好的线性关系(r等于0.999 9).结论：本法简便、准确,重复性好,可用于该产品的质量控制.

[关 键 词 ] 高效液相色谱法；硫酸氢氯吡格雷；含量测定

[中图分类号] R927.2[文献标识码] A[文章编号]1673-7210（2011）03（c）-060-02

Content determination of Clopidogrel hydrogen sulfate by HPLC

LU Jie1, MENG Xiangjun2, WANG Fengqiu1

1.Liaoning College of Health Vocational Technology, Shenyang 110101, China, 2.Medical Center of Shenyang Medical College, Shenyang 110034, China

[Abstract] Objective: To establish a method for determination the content of Clopidogrel hydrogen sulfate． Methods: Sino Chrom ODS-BP column (4.6 mm×200 mm,5 μm) was used, mobile phase was 1％ triethylamine (pH等于4.0)-acetontrile (25:75),detection welength was 225 nm． Results: Clopidogrel hydrogen sulfate sample size located 0.48-0.72 μg, and fourable linear correlation (r等于0．999 9) was showed． The flow rate was 1.0 ml/min. Conclusion: The method is convenient and accurate. Meanwhile, it also has good reproducibility, may be used to quality control of Clopidogrel hydrogen sulfate．

[Key words] HPLC, Clopidogrel hydrogen sulfate, Content determination

硫酸氢氯吡格雷（Clopidogrel）是一种血小板聚集抑制剂,临床上用于预防和治疗因血小板高聚集状态引起的心、脑及其他动脉的循环障碍疾病[1-3].硫酸氢氯吡格雷的质量标准收载于国家药品转正标准47册,其标准号WS1-(X-471)-2003Z,本标准中硫酸氢氯吡格雷含量测定采用高效液相色谱法,使用内标法测定,经试验其柱效与分离度均达不到要求,笔者参照《美国药典》和国外相关文献[2-6],对色谱条件进行优化.试验结果表明,笔者采用的色谱条件,具有分离度好、柱效高等优点,适合本品含量测定的要求.现报道如下：

1.仪器与试药

1.1 仪器

UV200 Ⅱ高效液相色谱仪（大连依利特科学仪器有限公司）；SunRun Express 色谱数据工作站（EC2000）；电子天平（AUY-120岛津-上海公司）；SinoChrom ODS-BP色谱柱（4.6 mm×200 mm,5 μm,大连依利特科学仪器有限公司）.

1.2 试药

乙腈（色谱纯,天津市四友精细化学品有限公司）；甲醇（色谱纯,天津市四友精细化学品有限公司）；三乙胺（分析纯）；硫酸氢氯吡格雷对照品（沈阳医学院药物中心）；硫酸氢氯吡格雷样品（批号：20090401、20090402、20090403,沈阳医学院药物中心）.

2.方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SinoChrom ODS-BP (4.6 mm×200 mm,5 μm)；流动相：1％三乙胺(pH等于4.0)-乙腈（25∶75）；检测波长：225 nm；流速：1.0 ml/min,进样量：20 μl；理论板数按硫酸氢氯吡格雷峰计算应不低于5 000.

2.2 检测波长的选择

精密称取硫酸氢氯吡格雷对照品适量,加甲醇制成每毫升中含30 μg的溶液,摇匀,照紫外分光光度法（《中国药典》2010年版二部附录ⅣA）,在190～400 nm处扫描,溶液在218 nm波长处有最大吸收.考虑溶剂干扰等因素,参考文献[2],确定测定的检测波长为225 nm.

2.3 系统适用性试验

取硫酸氢氯吡格雷对照品（由硫酸氢氯吡格雷原料精制而得,沈阳医学院药物中心）约32.7 mg（相当于氯吡格雷25.0 mg）,精密称定,置25 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得.

取对照品溶液20 μl注入高效液相色谱仪,记录色谱图.理论板数：N等于87 286,按硫酸氢氯吡格雷峰计算应不低于5 000.硫酸氢氯吡格雷与其他杂质峰的分离度R等于8.22＞1.5.图谱见图1.

2.4 线性关系试验

取硫酸氢氯吡格雷对照品32.7 mg,精密称定,置25 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,再分别精密量取上述溶液0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 ml置25 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,分别精密量取20 μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,以检测量为横坐标,峰面积为纵坐标进行回归,得回归方程Y等于1 542.2X+2.216（r等于0.999 9）.结果表明,硫酸氢氯吡格雷检测量在0.48～0.72 μg范围内线性关系良好.结果见图2.

2.5 稳定性试验

精密称取硫酸氢氯吡格雷原料32.7 mg,置25 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀.精密量取1.5 ml,置50 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度摇匀.室温放置,分别于0、1、2、3、4 h检测,计算其含量.RSD为0.44％,表明样品溶液在4 h内稳定.

2.6 精密度试验

2.6.1重复性试验

精密称取硫酸氢氯吡格雷原料32.7 mg,置25 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀.精密量取1.5 ml置50 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度摇匀.连续检测6次,计算其含量.RSD为0.42％,其重复性良好.

2.6.2 重现性试验

精密称取硫酸氢氯吡格雷原料32.7 mg,连续称定6份,置25 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀.精密量取1.5 ml置50 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度摇匀.计算其含量.RSD为0.36％,其重现性良好.

2.7 定量限试验

精密称取硫酸氢氯吡格雷对照品32.7 mg,置25 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀.精密量取适量制成以氯吡格雷计浓度为0.15 μg/ml的溶液.精密量取20 μl注入液相色谱仪中,记录色谱图.按10倍信噪比S/N计,定量限约为3 ng.

2.8 灵敏度试验

精密称取定量限试验项下溶液1 ml,稀释至5 ml,混匀（0.03 μg/ml）.精密量取20 μl注入液相色谱仪中,记录色谱图,按3倍信噪比S/N计,最低检测限为0.6 ng.

2.9 样品含量测定

取硫酸氢氯吡格雷原料（沈阳医学院药物中心,批号：200900401、20090402、20090403）,精密称取适量（约相当于氯吡格雷25 mg）,置25 ml量瓶中,加甲醇适量使硫酸氢氯吡格雷溶解并稀释至刻度,摇匀,再分别精密量取1.5 ml,置50 ml量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,精密量取续滤液20 μl,注入液相色谱仪,记录色谱图；另取硫酸氢氯吡格雷对照品适量（约相当于氯吡格雷25 mg）,同法测定,按外标法以峰面积计算,即得.结果见表1.样品与标准品含量测定图谱见图2、3.

3.讨论

参考相关文献,对流动相进行优化选择,考察乙腈与三乙胺不同配比对硫酸氢氯吡格雷出峰时间的影响,发现增加乙腈比例有利于缩短保留时间,当三乙胺-乙腈为25∶75时,保留时间在8 min左右,能满足含量测定的要求.同时也考察了流动相pH对拖尾因子的影响,发现减小pH有利于消除拖尾,可能是因为酸性条件抑制组分的解离,增加中性分子存在的几率,增加组分在固定相中的溶解度,从而减少拖尾.当pH等于4时,拖尾因子在0.95～1.00范围内,符合检测要求.本法测定硫酸氢氯吡格雷含量专属性强,结果准确、灵敏、快速,为硫酸氢氯吡格雷的质量控制提供了较好的方法.

[参考文献]

[1]袁静.氯毗格雷的药理学、临床疗效和耐受性[J].中国临床药学杂志,1999,8(4):69-70.

[2]Mitakos, Panderi, Validated LC method for the determination of clopidogrel in pharmaceutical preparations [J]. Journal of Pharmaceutical and Biochemical Analysis,2002,28(3):431-438.

[3]孙立平,张林潮.氯吡格雷在冠心病中的应用[J].医学综述,2006,12(19):1190-1192.

[4]国家药典委员会.新药转正标准:硫酸氢氯吡格雷[S].WS1-(X-471)-2003Z.

[5]美国药典委员会.美国药典[M].30版.北京:中国知识出版社,2005.

[6]Gandhimathi M, Ri TK. High Performance liquid Chromatographic determination of aspirin and clopidgrel in tablets [J]. Indian J pharm Sci,2007,69:123-125.

（收稿日期：2010-12-17）

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