重组大肠杆菌E.coliP84A/MC1061发酵生产卤醇脱卤酶的

摘 要：用基因工程大肠杆菌 E.coli P84A/ MC1061生产卤醇脱卤酶,此后,进一步进行了酵母浸出物FM888与酵母蛋白胨FP101的联合调控作用研究.结果表明,用高溶解度酵母浸出物FM888替代原配方中的牛骨蛋白胨,可使E. coli P84A/ MC1061生长速率增大,发酵稳定期的菌体浓度保持在较高水平,酶活提高了约2.4倍.当补料培养基中的FM888与酵母蛋白胨FP101的比例为7∶3时,菌体浓度保持在较高水平（OD600≥120）,酶活进一步提高约50%,大大提高了单罐产率.此研究可为其他酶制剂的发酵生产提供借鉴.

关 键 词 ：卤醇脱卤酶；发酵控制；酵母浸出物；酵母蛋白胨

中图分类号：Q939.9 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.07.002

Study on the Halohydrin Dehalogenases Produced by Rebinant E.coli P84A/ MC1061

PAN Dong-rui1, LI Xiao1,2, ZHANG Yao1, LI Jian-hua2, TAN Ya-li1

（ 1. College of Chemistry and Biology, China Three Ges University, Yichang, Hubei 443003,China； 2. Angel Yeast Company Limited, Yichang, Hubei 443003, China）

Abstract： In this research, the rebinant E. coli P84A / MC1061 was utilized to produce halohydrin dehalogenases. With the ox bone peptone in the original formula replaced by the high solubility yeast extract yeast extract FM888, the growth rate of E. coli P84A/ MC1061 increased largely, and its dry cell weight maintained at a higher level in the stationary phase, what’s more, the enzyme activity increased by 2.4 times. Then, integrating FM888 and yeast peptone FP101 into the regulation of the fed batch fermentation, the biomass maintained at a higher level （OD600≥120） and enzyme activity increased by about 50% when the proportion of FM888 and FP101 was 7∶3. This research could be used for reference by other industrial enzymatic production.

Key words： halohydrin dehalogenases； fermentation control； yeast extract； yeast peptone

E. coli P84A /MC1061中含有卤醇脱卤酶外源基因的质粒,在添加L-阿拉伯糖诱导[1]后,可随菌体生长而在胞内表达卤醇脱卤酶.卤醇脱卤酶也叫卤醇-卤化氢裂解酶[2],在催化环氧化物和邻卤醇之间的转化反应中,卤醇脱卤酶具有很高的立体选择性,因而在手性药物合成方面也有广阔的应用前景.序列同源性搜索以及二级、结构预测表明,卤醇脱卤酶的结构相似于短链脱氢酶/还原酶家族（SDRs）,它的3个重要的催化残基分别是：Tyr 145、Ser132和Arg149 [3] .卤醇脱卤酶是目前世界范围内的一个全新的研究领域,目前的研究均仅限于卤醇脱卤酶基因的改造和优化[4],对于大肠杆菌发酵生产卤醇脱卤酶的影响因素及过程调控的研究甚少,且国内外培养重组大肠杆菌生产卤醇脱卤酶的研究中,至今未报道培养基氮源的优化.而利用大肠杆菌生产其他蛋白的培养基氮源使用也都仅限于动物蛋白胨（酪蛋白胨、胰蛋白胨等）[5]和植物蛋白胨（大豆蛋白胨等）[6].

由于卤醇脱卤酶被广泛应用于医药中间体的生物催化合成[7],故该酶制剂的安全性显得尤为重要.本研究突破性地利用酵母蛋白胨发酵生产卤醇脱卤酶,舍弃常用的动植物类蛋白胨,可避免动植物蛋白胨可能带来的致病性、风俗禁忌问题以及过敏性问题.

本研究中将经典培养基配方中的牛骨蛋白胨用试剂级酵母浸出物FM888替代,在摇瓶和50 L全自动控制反应器中考察卤醇脱卤酶的表达情况.在此基础上,在补料分批发酵中进一步研究酵母浸出物FM888与酵母蛋白胨FP101对卤醇脱卤酶发酵生产的联合调控作用.

1.材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种 重组大肠杆菌E.coli P84A /MC1061,由安琪酵母股份有限公司菌种室提供.

1.1.2 试 剂 L-阿拉伯糖（L（+）-Arabinose）,购于Sigma公司.酵母浸出物FM888和酵母蛋白胨FP101由安琪酵母股份有限公司生产.其他试剂均为分析纯AR.

1.1.3 种子培养基[8] 斜面培养基：甘油8 g·L-1,酵母浸出物（FM818）25 g·L-1, NaCl 6 g·L-1, KH2PO4 4.25 g·L-1,K2HPO4 4.25 g·L-1,Na2HPO4 8.5 g·L-1,MgSO4·7H2O 1 g·L-1,琼脂粉15 g·L-1. 液体种子培养基：甘油 8 g·L-1,蛋白胨 10 g·L-1,FM818 15 g·L-1,氯化钠 6 g·L-1,磷酸氢二钠 8.5 g·L-1,磷酸氢二钾 4.25 g·L-1,磷酸二氢钾 4.25 g·L-1,硫酸镁 1 g·L-1.调pH值为7.1.

1.1.4 诱导剂溶液 浓度为 0.05 g·mL-1 L-阿拉伯糖溶液.

1.2 主要测定方法

1.2.1 种子培养方法 摇瓶种子培养：将斜面菌样接入装有25 mL液体培养基的250 mL的三角瓶中,在30 ℃和200 r·min-1摇床上培养20 h.

1.2.2 发酵培养及诱导产酶 摇瓶发酵：将种子液接入发酵摇瓶后,在30 ℃,200 r·min-1条件下培养2 h向发酵液中加入0.5 mL L-阿拉伯糖溶液,培养时间为24 h.

50 L罐发酵：接种量2%；空气流量比为1.1 vvm；搅拌转速200～500 r·min-1；培养温度30 ℃；罐压0.04 MPa；采用间歇式补料.培养时间为24 h.

1.2.3 菌体量测定 方法参见参考文献[9].

1.2.4 卤醇脱卤酶酶活力测定 参考文献[10].

1.2.5 氨基氮测定 参考文献[11].

1.2.6 氨基酸测定 参考文献[12].

1.3 试验设计

1.3.1 摇瓶及50 L发酵罐分批发酵试验方案 发酵培养基配方中常加入一定浓度的蛋白胨,本研究中的对照组,即为经典培养基方案（1组）（表1）.而试验组是将1组中的牛骨蛋白胨全部用酵母浸出物FM888取代,即2组,再进行摇瓶发酵和50 L罐动态控制发酵,比较两种方案下对卤醇脱卤酶表达的影响.

1.3.2 酵母浸出物FM888与酵母蛋白胨FP101的联合调控试验方案 在动态考察酵母浸出物含量对卤醇脱卤酶表达的影响后,为进一步深入研究酵母浸出物FM888和酵母蛋白胨FP101调控配比,接着进行50 L补料发酵.通过改变菌种原始培养基中N源的比例,做对比研究,试验配比见表2.试验数据对比,验证补料中添加适量酵母蛋白胨对重组菌生长以及产酶的影响.

2.结果与分析

2.1 摇瓶发酵试验

试验结果表明（表3）,第2组中以等质量的酵母浸出物取代牛骨蛋白胨后,pH值回升快,OD600明显增大,说明E.coli P84A /MC1061能快速利用培养基中的碳氮源,菌体生长速率加快卤醇脱卤酶活力有一定幅度提高,此外,也说明卤醇脱卤酶的表达量与生物量的积累存在正相关关系.

2.2 50 L罐分批发酵试验

50 L罐分批发酵过程酶活变化趋势如图1所示.由图知,1组酶活在14 h达最大值75 680 U·mL-1,发酵过程中酶活呈先上升后下降的趋势；2组酶活在24 h达最大值180 621 U·mL-1,发酵过程中酶活呈持续上升趋势,比1组的酶活提高了2.4倍.这说明将培养基中的牛骨蛋白胨全部替换成酵母浸出物FM888可明显提高卤醇脱卤酶的表达量.

2.3 酵母浸出物FM888与酵母蛋白胨FP101联合调控的结果

按照表2中的4组方案设计在50 L发酵罐中进行补料发酵试验,测定结果如图2和3所示.4个设计组中,其发酵过程非常相似,0～2 h为延滞期,2～20 h为对数生长期,20～30 h为稳定期.稳定期的生物量相差不大,最小值100,最大值120.但酶活力有着明显的差异,最大值比最小值约高出10万U·mL-1.

当采用第1组配方后,当初始培养基和补料培养基中氮源均使用FM888时,生物量的积累相对较小,酶活值较低.

在第2组配方中,当把底料中以30%酵母蛋白胨FP101等质量替换FM888,补料氮源全采用FM888时,前期菌体量生长依旧相对缓慢,但后期菌体量明显加速上升,酶活力相对有较大提升.

第3组配方中,当发酵底料氮源全采用FM888不变,把补料氮源改为以30%酵母蛋白胨等质量替换FM888时,发酵前期菌体量虽有较快生长,但后期菌体量和酶活力均呈现出后劲不足,发酵后期上升幅度较小.

在第4组配方中,当发酵底料和补料N源均以30%酵母蛋白胨等质量替换酵母浸出物FM888时,可以得出,发酵周期的后期比生长速率较小,但表现出较大的发酵后劲,酶活力有着明显的提高,在整个发酵过程中,酶活力一直有着较大的增幅.与第1组发酵结果相比,酶活提高约50%.

2.4 酵母浸出物FM888、牛骨蛋白胨和酵母蛋白胨FP101氨基酸含量分析

为探究各配比设计组出现不同趋势的原因,用氨基酸分析仪对酵母浸出物FM888、牛骨蛋白胨和酵母蛋白胨FP101进行氨基酸含量测定,游离氨基酸和水解氨基酸含量结果分别如图4、5所示.

由图4、5可知,除了精氨酸（L-Arg）外,牛骨蛋白胨的各种游离氨基酸的含量大大低于FM888的.除了甘氨酸（L-Gly）、脯氨酸（L-Pro）、丙氨酸（L-Ala）和精氨酸（L-Arg）外,其他各水解氨基酸的含量均低于FM888的.

除精氨酸（L-Arg）、丙氨酸（L-Ala）外,酵母蛋白胨FP101游离氨基酸的含量在FM888和牛骨蛋白胨之间.就水解氨基酸而言,除甘氨酸（L-Gly）、脯氨酸（L-Pro）和精氨酸（L-Arg）含量低于牛骨蛋白胨,缬氨酸（L-Val）、异亮氨酸（Ile）和精氨酸（L-Arg）含量低于FM888外,其余水解氨基酸的含量均高于牛骨蛋白胨和FM888.

以上说明,牛骨蛋白胨大分子肽类含量高,而小分子肽类和游离氨基酸含量较低,微生物对其利用速率低,生物量积累速率低；FM888的游离氨基酸含量高,而肽类含量较低,微生物对其利用快,但持续增效作用不够；FP101的肽类总含量和游离氨基酸总含量介于FM888与牛骨蛋白胨之间.当FM888与FP101以一定比例混合使用时,可将游离氨基酸和肽类含量调整到合适水平,既能满足菌体快速生长的营养需求,又可促进卤醇脱卤酶的持续高效表达,增强发酵后劲. 3 结 论

将经典的卤醇脱卤酶发酵培养基配方中的牛骨蛋白胨用试剂级酵母浸出物FM888替代时,由于酵母浸出物含有较多的游离氨基酸,导致生物量的快速积累,卤醇脱卤酶的表达量较高,后者是前者的2.4倍.将酵母浸出物FM888与酵母蛋白胨FP101以7∶3的比例加入初始培养基及补料培养基中,游离氨基酸和肽类含量被调整到合适水平,酶活在原来基础上提高50%.

此外,由于FM888和FP101的原料来源于面包酵母,无转基因争议、无致病性、无过敏原、无风俗禁忌等问题,如果将它们广泛的应用于食品及药品的发酵生产,一方面可保证产品的安全性,另一方面有助于用户通过KOSHER、HALAL等国际认证, 以适应广大消费者对食品、药品安全性日益提高的要求.此研究可为酵母蛋白胨替代传统的动植物蛋白胨的发酵生产提供借鉴.

[10] Fox R J, Dis C S, Mundorff E C, et al. Improving catalytic function by ProSAR-driven enzyme evolution[J]. Nat Biotechnol,2007, 25：338-344.

[11] 卜凤泉,刘忠英,胡秀丽,等. 测定磷脂中氨基氮的新方法[J]. 食品科学,2003（5）：87-91.

[12] CAO Yi,QIAO Dai-rong,JIANG Yan, et al. Amino acids analysis in different antigens and relationship with immunoreactivity in cysticercus cellulosae[J]. Agricultural Sciences in China,2002,1（8）：929-933.