HPLC―ELSD测定养血益肾胶囊中黄芪甲苷的含量

摘 要 ：目的 建立养血益肾胶囊的质量标准.方法 采用薄层色谱法对天麻、淫羊藿、丹参进行定性鉴别.采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法对黄芪甲苷含量进行测定,Diamonsil C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm,5 m）,乙腈-水（33∶67）为流动相等度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温35 ℃,检测器为蒸发光散射检测器,漂移管温度105 ℃,空气流速2.7 L/min.结果 薄层色谱法得到的结果斑点清晰,重复性好.黄芪甲苷在进样量0.397 0～5.955 0 g范围内峰面积的自然对数与进样量的自然对数线性关系良好,r等于0.999 9,平均加样回收率为102.0%,RSD等于1.5%（n等于6）.结论 本方法简便快捷,适于该制剂的质量控制.

关 键 词 ：养血益肾胶囊；黄芪甲苷；薄层色谱法；高效液相色谱-蒸发光散射检测器

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.07.019

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）07-0052-03

Determination of Astragaloside IV in Yangxue Yishen Capsules by HPLC-ELSD PENG Juan, YAN Han, GUO Na, NIE Ying-lan, FAN Bin （Experimental Research Center, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China）

Abstract：Objective To establish the quality standard for Yangxue Yishen Capsules. Methods Rhizoma Gastrodiae, Herba Epimedii and Radix et Rhizoma Salviae Miltiorrhizae in the formula were identified qualitatively by TLC. The content of Astragaloside IV was determined by HPLC-ELSD method. The Diamonsil C18（2） column （4.6 mm×250 mm, 5 m） was used. The mobile phase was acetonitrile-water （33∶67） with 1.0 mL/min flow rate at 35 ℃. The temperature of drift tube for ELSD was 105 ℃, the air flow rate was 2.7 L/min. Results The TLC displayed clear spots on their right positions repeatedly. The linear range of Astragaloside IV was 0.397 0-5.955 0 g （r等于0.999 9）. The erage recovery was 102.0%, RSD was 1.5% （n等于6）. Conclusion The method is simple and quick. It can be used as quality control method of Yangxue Yishen Capsules.

Key words：Yangxue Yishen Capsules；Astragaloside IV；TLC；HPLC-ELSD

养血益肾胶囊为北京市朝阳区双安医院院内制剂,由赤芍、白芍、女贞子等组成,具有养血活血、健脾益肾、润肤生发的功效,用于治疗血虚血燥、脾肾不足引起的皮肤粗糙、血鳞病、脱发、斑秃、神经性皮炎.本研究采用薄层色谱法对该制剂中天麻、淫羊藿、丹参进行鉴别,用高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC-ELSD）测定黄芪甲苷的含量,以控制养血益肾胶囊的质量,现报道如下.

1.仪器与试药

美国Agilent1200高效液相色谱仪：G1311A四元泵,G1329A

通讯作者：范斌,Tel：010-64014411-3324,E-mail：binf@ 263.

自动进样器,G1316A柱温箱,Agilent chemstation化学工作站,蒸发光散射检测器Alltech ELSD 2000.赛多利斯arium 61316/611VF超纯水处理器,赛多利斯 BT25S、BT423S分析天平.离心机Anke TDL-5-A,上海安亭科学仪器厂.超声波提取仪JN-5200DT,宁波江南仪器厂.

黄芪甲苷对照品（批号110781-200613）、天麻素对照品（批号110807-200205）、淫羊藿苷对照品（批号110737- 200415）、原儿茶醛对照品（批号110810-200506）均由中国药品生物制品检定所提供.3批养血益肾胶囊样品（批号100401、100402、100403）由北京市朝阳区双安医院提供.乙腈为色谱纯（北京迪科马科技有限公司）,无水乙醇为分析纯（北京化工厂）,超纯水为自制.

2.薄层鉴别

2.1 天麻

分别称取养血益肾胶囊内容物（3批）各10 g,加入水饱和正丁醇40 mL,超声处理30 min,滤过,滤液蒸干,残渣加水5 mL使溶解,3500 r/min离心5 min,吸取上清液通过D101大孔树脂柱（内径1.5 cm,长12 cm）,分别以10%乙醇,50%乙醇和95%乙醇各25 ml进行洗脱,收集10%乙醇和95%乙醇洗脱液,70 ℃水浴蒸干,取10%醇洗液的残渣,加甲醇1 mL使溶解,作为供试品溶液.精密称取天麻素对照品,加甲醇制成1 g/L的对照品溶液.再按处方比例,取缺天麻的其他各味药,按制备工艺加工制成阴性样品,按供试品制备方法制成阴性对照溶液.照薄层色谱法[1]试验,吸取供试品、对照品和阴性对照溶液各15 L,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（8∶1∶3∶0.1）为展开剂,饱和30 min,展开,取出,晾干,喷以10%磷钼酸乙醇溶液,110 ℃加热至斑点显色清晰.供试品色谱中,在与对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,阴性对照无此斑点. 4.010 8 263.495 5 95.28 360.679 9 102.0 102.0 1.5

3.712 6 243.904 8 95.28 340.033 2 100.9

4.597 3 302.026 5 95.28 401.999 2 104.9

3.795 6 249.357 6 95.28 345.509 5 100.9

3.11 样品含量测定

分别取3批样品,按“3.3”项下方法制备供试品溶液,按外标两点法计算供试品黄芪甲苷的含量,结果见表2.

表2 样品中黄芪甲苷含量测定结果（g/g,n等于3）

批号 黄芪甲苷含量

100401 65.312 3

100402 76.844 6

100403 79.563 8

4.讨论

本试验中曾分别采用2010年版《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）天麻、淫羊藿【鉴别】项下的方法对天麻、淫羊藿进行薄层鉴别,但天麻素、淫羊藿苷未能检出.可能是由于该组方成分较复杂,一些水溶性大的成分严重干扰了薄层色谱的分析,因此参考《药典》天麻丸【鉴别】项下样品处理方法,通过D101大孔树脂柱纯化后再进行鉴别,参考文献[3-5],考虑到天麻素、淫羊藿苷均属于极性较强的苷类物质,故在试验中设计了用不同浓度的乙醇进行洗脱,分别进行检测的方法.在试验中发现,鉴别淫羊藿苷时,喷显色剂后,随着放置时间的延长,斑点颜色由暗变亮,放置40 min,紫外365 nm下检视,斑点呈亮,颜色清晰,故最终确定喷显色剂后,放置40 min再检视.本试验确定样品经D101大孔树脂纯化后,可分别对天麻、淫羊藿进行鉴别,方法准确、可靠、简便.

笔者曾采用2010年版《药典》丹参【鉴别】项下的方法对丹参进行薄层鉴别,但丹参丹参酮ⅡA和丹参酮B均未检出.参考文献[6-9],采用30%、50%、95%乙醇分别洗脱,经鉴别,95%乙醇洗脱液中未检出原儿茶醛,50%乙醇洗脱液在与原儿茶醛相应位置有相同颜色斑点,且斑点清晰.该方法灵敏、准确、可靠.

在黄芪甲苷含量测定的供试品溶液制备时,参照《药典》及有关资料考查了甲醇、无水乙醇提取,结果显示甲醇与无水乙醇提取差别不显著,考虑到无水乙醇毒性较小,对环境污染小,以无水乙醇提取为佳.考察了不同超声时间对提取效果的影响,结果提取20 min可提取完全.

黄芪甲苷极性较大,仅有末端吸收,吸收波长200 nm,易受试剂的干扰,流动相种类受到限制,亦无专一显色剂,使用紫外检测法存在一定不足,故采用HPLC-ELSD.该方法无干扰,重复性好,且灵敏稳定,适用于养血益肾胶囊中黄芪甲苷的含量测定.

关于色谱条件,考察了流动相不同比例,乙腈-水（40∶60、33∶67）,以后者的条件黄芪甲苷与干扰峰分离完全.考察了蒸发光检测器条件,改变漂移管温度（90、100、105 ℃）及空气流速（2.0、2.5、2.7 L/min）,结果以漂移管温度105 ℃、空气流速2.7 L/min条件时黄芪甲苷峰形对称,此条件为最佳.