金雀异黄素衍生物dFMGEN体内外抑制人乳腺癌MCF―7细胞增殖作用

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【摘 要 】 目的:观察金雀异黄素(genistein,GEN)衍生物7-二氟亚-5,4’-二-正辛烷氧基异黄酮(dFMGEN)对 MCF-7细胞体内外增殖的影响.方法:dFMGEN处理MCF-7细胞后,采用MTT法检测dFMGEN对乳腺癌MCF-7细胞的体外细胞增殖的影响;PI染色流式细胞术分析dFMGEN对细胞周期和凋亡的影响;建立MCF-7裸鼠异种移植瘤模型检测dFMGEN体内抑制乳腺癌增殖的作用.结果:dFMGEN可显著抑制人乳腺癌MCF-7细胞的体内外增殖,使MCF-7细胞阻滞于G1期.结论:金雀异黄素衍生物dFMGEN具有抑制乳腺癌细胞的增殖作用,其机制可能与其诱导细胞G1期阻滞相关.

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【关 键 词 】 乳腺癌; 金雀异黄素; 衍生物; 细胞周期

中图分类号 R737.9 文献标识码 B 文章编号 1674-6805(2013)36-0147-02

金雀异黄素(genistein,GEN)是在大豆中天然存在的异黄酮类物质.研究表明,GEN是一种强力的酪氨酸蛋白激酶和拓扑异构酶抑制剂,能通过多种途径在体外显著抑制多种细胞的生长[1].但由于其在体内很难达到有效的血药浓度,因而限制其体内的抗肿瘤作用的发挥[2].为增加GEN体内的生物学活性,研究者们试图对金雀异黄素进行结构改造[3],以期提高其体内抗肿瘤作用.本实验旨在前期对GEN进行结构改造研究基础上进一步研究GEN衍生物dFMGEN体内外抗乳腺癌MCF-7细胞增殖的作用.

1.材料与方法

1.1 药物和试剂

金雀异黄素衍生物dFMGEN合成方法详见参考文献[4].金雀异黄素、二亚砜(DMSO)、MTT为Sigma公司产品;PRMI-1640培养基等细胞培养用试剂为Gibco公司产品.

1.2 方法

1.2.1 细胞与细胞培养 人乳腺癌细胞MCF-7购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC).细胞培养于含10%小牛血清(FCS),1×105 U/L链霉素及1×105 U/L青霉素的RPMI-1640培养基中常规培养传代,取对数生长期细胞用于实验.

1.2.2 MTT实验检测dFMGEN对细胞增殖的影响 按1.5×104/孔的密度接MCF-7细胞种于96孔板,待细胞贴壁后加入20 μl不同浓度dFMGEN,使其终浓度分别为5、10、20、40 μM,GEN对照组为40 μM的GEN,GEN对照组加入相同体积含终浓度为0.1% DMSO的完全培养基,每组设6个复孔,分别处理24 h或48 h.在培养结束前4 h每孔加入5 g/L MTT 20 μl,显示后用酶标仪(EX-800型)在570 nm波长测吸光值(A值).

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期及凋亡 收集经不同药物处理的dFMGEN细胞,冷PBS洗2遍,用4 ℃的70%乙醇固定24 h后,经碘化丙啶(PI)染色,用流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况.

1.2.4 裸鼠异种移植瘤治疗实验 取雌性Balb/c-nu小鼠20只,4周龄,体重约9~11 g,调整MCF-7细胞浓度为3×107/ml,按

0.2 ml/只接种于小鼠背部皮下,出现移植瘤后按公式V等于W2(短径)×L(长径)×0.52计算瘤体积,待移植瘤体积达100 mm3左右时随机分为5组,即对照组(含0.1% DMSO的PBS);GEN对照组(GEN 45 mg/kg);低、中、高剂量dFMGEN组(dFMGEN 5、15、45 mg/kg).各组均隔日经腹腔注射给药1次,共计10次,末次给药48 h后脱臼处死小鼠,称取瘤及肝脾重量.

1.3 统计学处理

采用SPSS 12.0统计软件分析数据,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,进行One-way ANOVA检验及t检验,P<0.05为差异有统计学意义.

2.结果

2.1 dFMGEN对体外培养的MCF-7细胞增殖的影响

采用MTT法检测不同浓度dFMGEN或GEN对MCF-7细胞生长的影响,dFMGEN能呈时间-剂量依赖性抑制体外培养的人乳腺癌MCF-7细胞增殖,且作用强于母体化合物GEN的GEN对照组(P<0.05),详见表1.

2.2 dFMGEN和Genistein对MCF-7细胞周期及凋亡的影响

流式细胞术检测结果提示,10、40 μM的dFMGEN作用于MCF-7细胞48 h后,其G1期细胞分别为65.6%和81.6%,较空白对照组和40 μM Gen处理组的51.5%和63.4%有明显提高(P<0.05),呈现出明显的G1期阻滞现象,但其对细胞的凋亡的影响不明显.

2.3 dFMGEN对人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠异种移植瘤生长的影响

治疗模型发现实验组裸鼠体重、肝脾重量与对照组比较,dFMGEN对瘤生长大小的影响呈现出明显的剂量依赖性,dFMGEN体内抗瘤作用明显强于GEN对照组(P<0.05),详见表2.

3.讨论

本研究中,笔者将二氟亚导入GEN后,其抗肿瘤作用明显增强(P<0.05).进一步的研究发现,dFMGEN体外抑制MCF-7增殖作用并不是通过促进细胞凋亡,而是作用于细胞周期.这一结果与笔者在前期研究中报道的dFMGEN对A549细胞的影响相类似[4].Du等[5]研究发现flopiridol能够诱导HL-60细胞凋亡,但是不能诱导A549细胞出现凋亡.结合前期的研究结果[4],笔者认为dFMGEN可能是一个G1期阻滞剂.如果将dFMGEN与G1期特异性抗肿瘤药物联合使用,可能能够发挥很好的协调作用.

由于体内的生长环境较复杂,药物需通过肠系膜的吸收及肝脏的代谢等才能发挥抗肿瘤作用,这也就导致了一些药物体内外研究结果不一致[7].如实验表明,尽管GEN在体外可抑制乳腺癌细胞的生长,但是对裸鼠的乳腺癌细胞异种移植瘤却并不能获得相同的效果,与此相反,由于它在体内的吸收效果较差,不能达到体外抑制时的浓度,使得GEN在低浓度时所具有的雌激素样作用得到发挥而刺激肿瘤的生长[6].因此,在本实验中为了进一步评价dFMGEN的体内抗肿瘤效果,笔者成功地建立了人乳腺癌MCF-7细胞裸鼠异种移植瘤模型并对其通过腹腔注射给药进行体内治疗试验,结果发现高剂量dFMGEN处理后在体内对肿瘤的抑制率为81.6%,而相同剂量的GEN体内抑制率仅为56.4%.其原因可能是将含氟基团引入GEN后,能极大的改善其理化性质和生物学活性[8],而且C-F键能大大增加化合物的亲脂性,使含氟化合物能够更易透过组织细胞膜,从而提高含氟化合物在生物体内的吸收和转运,进而发挥更强的体内抗肿瘤作用[9].总之,本研究结果为开发新的、具有应用前景的抗乳腺癌新药提供了理论依据. 参考文献


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(收稿日期:2013-07-14) (编辑:朱姣)