含盐石油开采废水的微生物

摘 要：石油开采过程中产生的废水,处理方式已成为国内外研究的重要课题.一般来说微生物在适当的渗透压下生长良好,渗透压过高会导致微生物细胞因脱水过多而无法进行正常的代谢活动,过低则易因基质中缺乏必要的无机离子而影响细胞的存活.

本实验以筛选、驯化能够高效降解高盐高有机物的石油开采废水的菌株和高效菌株特性分析为主要研究内容.本实验以模拟石油开采废水的高盐度、高有机物的特性配置的水样为研究基础,通过筛选、分离、富集,筛选出可以在高盐度、高有机物的环境下生存的三种菌株Z1、Z2、Z3.然后进一步将这三种菌株作为研究对象研究其生理生化性质等,选定可以高效处理有机物的两种菌株Z2、Z3.Z2、Z3适宜生长在pH8～9的普通培养基中,耐碱；两菌株适应在不同氯化盐中生长,可以耐受高渗透压的环境,CaCl2浓度高达7.2%时仍可较好的生长；可以耐受较大浓度的有机物10ml/L下仍可以生长,具有较短的停滞期,大约为3h左右.

关 键 词：石油废水微生物高渗透压生物降解

石油开采过程中产生的废水是随着原油开采而出来,经过油气分离和脱水处理后而脱出的废水.石油开采过程中产生的废水水质成分比较复杂,因油田的地理位置及开采、炼制工艺的不同而有较大的差别,但油田废水普遍具有以下特点：①含石油类、表面活性剂等难降解有机污染物；②含盐度高,具一定的腐蚀性；③含杀菌剂；④高水温.因此,油田废水处理难度大,目前处理达标率仅为60%左右.石油开采过程中产生的废水是石油工业中产量最大的污水,约占油田开发所产出污水总量的85％以上.

注水开发是我国大部分油田采用的普遍方式,每生产1t原油约需注水2～3t,随着我国油田开发的规模越来越大,含有废水产生量也越来越多.大庆油田原油年产量连续保持在4000万吨以上,而废水每年达6300万吨；辽河油田原油年产量约2700万吨,而废水每年达4500万吨；胜利油田原油年产量3100万吨,而废水每年达5000万吨,目前我国油田综合含水高达90～95%,已经进入高含水采油阶段,每年污水产生量约为3.0亿m3以上.

石油开采废水水质极其复杂,一般含有溶解性石油,石油中的芳香烃、噻吩、吡啶、喹啉等均为高分子难降解有机物.在原油集输过程中需要添加降粘剂、破乳剂、絮凝剂等各种化学助剂,它们的组成复杂、来源不宜,这类有机物或其演变产物最后都存在于废水中构成废水COD的一部分.同时,采油废水在高温的油层中溶入了地层中的各种盐类和矿物质,含有大量的无机阴、阳离子如Cl-、S2-、Na+、Ca2+、Mg2+、K+等.海洋油田采出水中的氯离子浓度极高.这些废水中的芳烃和多环芳烃等具有强烈的三致作用,且难以降解；另外,高盐度的特性增加了采油废水的处理难度.现阶段处理采油废水一般都是经过隔油―气浮―过滤处理工艺（通常称老三套）处理,以除去水中的石油类和SS等物质,然后回注.目前,传统的处理技术已难以应对,生物处理技术因其运行费用较低,不产生二次污染且能做到无害化处理的优点而越来越受到重视及应用.人们已开始通过各种育种手段选育耐盐性以及高降解性的特殊细菌,用于处理特殊污水.筛选育种操作简单方便,在微生物育种中得到广泛应用.

1菌种来源

本实验所筛选的细菌来源于自己配制的模拟含盐石油开采废水中,模拟废水由93#97#汽油0#柴油、自来水、氯化钙配制.汽油柴油模拟废水中的石油有机物等,氯化钙模拟其盐度.

表1水样组成

一般石油开采废水的COD大约在120～700mg/L,盐度26.5～31.8g/L,Cl-约为10000～25000mg/L,石油类10～50mg/L,分别配制了五组盐度不同的水样A1、A2、A3、B、C.

2实验的基本流程如下图

3实验结果与讨论

3.1耐盐菌株的筛选

经过挑取单菌落,反复划线,共分理处三株菌落形态不同的菌株.然后经初步的筛选（在筛选培养基中生长良好）的三株耐盐菌,其菌落特征如下表：

表2菌株的形态特征

三株耐盐菌在电子显微镜下观察细菌细胞形态图如下图：（左右两图分别为染色和没有染色的观察图）

图1菌株Z1

图2菌株Z2

图3菌株Z3

通过观察可以看出,Z1为丝状杆菌,Z2为典型的球菌,Z3为短杆菌.

对初筛的三种菌进行菌种的复筛,培养条件是：温度35℃,pH为7.5的选择培养基中,培养基成分为选择培养基：蛋白胨10g,牛肉膏5g,氯化钠5g,蒸馏水1000ml,琼脂20g(固),氯化钙试需要而定.

耐盐能力见表3,从表3中可以看出,3株菌株菌能在0~3.6%氯化钙培养基内生长,但是菌株Z2和Z3还能在7.2%培养基内生长,而Z1却不能.微生物能够耐受高盐的存在而生长,并不意味着一定能降解含高盐的高盐石油废水中的有机污染物,因此,需进一步测定其对水样废水有机污染物的降解能力.

表33株优势菌株的耐盐实验

注：+++表示生长很好；++表示生长一般；+表示少量生长；-表示不生长.

3.2耐盐菌株的生长曲线

对耐盐菌株的生长曲线进行研究,事先用CaCl2调节选择培养基,选择培养基的成分为蛋白胨10g,牛肉膏5g,氯化钠5g,蒸馏水1000ml,琼脂20g(固),氯化钙盐度3.6%,即：盐度为20000mg/L,然后高压灭菌,用提前灭菌的NaOH准确调节pH7.5.每100ml加入5ml过夜培养的菌悬液,35℃恒温振摇(120rpm),在0～4.5h每1.5h在600nm下测其OD,4.5h以后每1h测一次.用722S分光光度计测其OD,

图4菌株生长曲线

从图中可以看出：Z1在刚接种到培养基中时其生长速率明显减慢,停滞期较长,大约为10h.而对于Z2、Z3来说停滞期相对较短,大约为3h.在短时间内即可适应环境,进入对数期快速生长.因此在实际应用中Z2、Z3有很大的优势.

综合以上研究,即选择耐盐且停滞期较短的Z2、Z3做后续研究.

3.3耐盐菌株在不同培养基生长

将菌株接种于不同氯化钙浓度的选择培养基和无机盐培养基中,35℃恒温振摇(120rpm),培养72h,测其OD,结果如图5、图6.

图5菌株Z2在不同培养基下的生长情况对照

图6菌株Z3在不同培养基下的生长情况对照

由图5、图6可以看出,菌株Z2和Z3都能在0～9.0%氯化钙的选择培养基中生长,具有很强耐盐能力,两者最适生长盐度范围均为0～3.6%.由于选择培养基的营养丰富,含有多种生长因子,菌体可以直接从培养基中吸收而不需要从头合成而消耗能量.

3.4菌株在其他氯化盐中的生长情况

配置四份分离培养基,pH为7.5,编号为A、B、C、D,四份培养基分别加入四种不同的氯化盐（氯化钠、氯化钙、氯化镁和氯化钾）,使氯离子浓度均为20000mg/L.35℃恒温振摇(120rpm),72h测其OD.

图7菌株Z2、Z3在不同氯化盐中的生长情况对照图

由图5、图6可以看出,菌株Z2和Z3氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙的培养基中生长,两菌株的应用范围较宽和性能较好.

3.5pH对菌株生长情况的影响

将培养过夜的细菌菌悬液lmL接种到不同pH且用提前灭菌的NaoH准确调节pH（4.5～11.0)的完全培养基中,35℃恒温振摇

(120rpm),2天后检测其在600nm的OD值.

图8pH对菌株生长的影响

从图8可知,两株菌株的最适pH值约在8～9左右,对酸敏感,耐碱,在pH值小于5.5大于10时,该菌株生长不好,基本不能生长.

环境中的pH值对微生物的生命活动影响很大,主要作用在于：引起细胞膜电荷的变化,从而影响了微生物对营养物质的吸收,影响代谢过程中酶的活性,改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性.每种微生物都有其最适pH值和一定的pH范围.在最适范围内酶活性最高,如果其他条件适合,微生物的生长速率也最高.微生物在基质中生长,代谢作用改变了基质中氢离子浓度.随着环境pH值的不断变化,微生物生长受阻,当超过最低或最高pH值时,将引起微生物的死亡.为了维持微生物生长过程中pH值的稳定,配制培养基时要注意调节pH值,而且往往还要加入缓冲物以保证pH在微生物生长繁殖过程中的相对稳定.

3.6温度对菌株生长情况的影响

将培养过夜的细菌菌悬液接种到新鲜的完全培养基中,使温度在10℃～48℃之间培养,35℃恒温振摇(120rpm),2天后检测其在600nm的OD值.

从生长温度来看,两菌株均属于中温型细菌,在30℃到35℃左右之间生长的最好.两菌株在45℃生长状况明显降低,且Z3耐受高温的能力略强一些.

可见,温度对菌株的生长有一定影响.原因如下：温度是影响有机体生长与存活的最重要的因素之一.它对生活机体的影响表现在两个方面：一方面随着温度的上升,细胞中的生物化学反应速率加快.在一般情况下,温度每升高10℃,生化反应速率加快一倍；另一方面,机体的重要组成如蛋白质、核酸等对温度都较敏感,随着温度的增高而可能遭受不可逆的破坏.因此,只有在一定范围内,机体的代谢活动与生长繁殖才随着温度的上升而增加,当温度上升到一定程度,开始对机体产生不利影响,如再继续升高,则细胞功能急剧下降以至死亡,故每个菌株都有其最好的温度生长范围.

图9温度对菌株Z2生长的影响

图10温度对菌株Z3生长的影响

3.7C源对菌株生长情况的影响

研究C源对菌株生长情况的影响培养过程是在四种培养基中分别加入淀粉、葡萄糖、乳糖、和蔗糖,然后加入蛋白胨做N源,等配置成不同C源的培养基,分别加入菌种培养24h,检测其在600nm的OD值.

图11C源对菌株生长情况的影响

两菌株均可以在四种C源下生长,但是Z2在葡萄糖和蔗糖的环境下明显生长情况较差,Z3在葡萄糖环境下生长情况较差,产生了酸,使pH下降,且上面得出两菌株菌的适宜生长环境为略碱性,所以,pH的降低阻碍了菌株的正常生长.

3.8N源对菌株生长情况的影响

图12N源对菌株生长情况的影响

研究N源对菌株生长情况的影响在四种培养基中分别加入氯化铵、硫酸铵、蛋白胨、和尿素,然后加入牛肉膏做C源,等配置成不同N源的培养基,分别加入菌种培养24h,检测其在600nm的OD值.

由图中可以看出两菌株都可以利用无机氮源氯化铵、硫酸铵和有机氮源蛋白胨、尿素,两菌株利用无机氮的能力极低,尿素的利用能力高于无机氮,在含有蛋白胨的培养基下生长情况最好,因为蛋白胨是混合物,可能含有很多菌株更容易利用的有机氮.

3.9菌株对石油类有机物的最大耐受限度

配置浓度梯度分别为0.1mL/L、1mL/L、5mL/L和10mL/L的水样培养菌株,35℃恒温振摇(120rpm),2天后检测其在600nm的OD值.

图13菌株Z2对石油类有机物的最大耐受限度实验

图14菌株Z3对石油类有机物的最大耐受限度实验

由图可知,两菌株均可以在石油类浓度在0.1mL/L、1mL/L、5mL/L和10mL/L的水样中生长,在浓度为0.1mL/L、1mL/L和5mL/L时生长良好.由此可以看出,两菌株均可耐受较大浓度的石油类有机物,高浓度时Z3的耐受性较Z2强.

4主要结论

筛选出了符合要求的两株具有良好有机物降解性能的耐盐菌.Z2、Z3适宜生长在pH值8～9的普通培养基中,耐碱；两菌株均属于中温型细菌,在30℃-35℃左右之间生长的最好；两菌株适应在不同氯化盐中生长,可以耐受高渗透压的环境,CaCl2浓度高达7.2%时仍可较好的生长；可以耐受较大浓度的有机物10ml/L下仍可以生长,具有较短的停滞期,大约为3h左右.

由于实验室条件有限不能实现对石油的降解效率进行分析所以此实验研究还有待改进和后续研究.