PCR技术在食品检验中的应用

[摘 要]食品行业属于环环相扣的生产、运营过程,食品不可避免在生产、流转及销售等环节受到各类微生物的污染,影响品质,因此我国实行微生物检测是监督食品安全的重要手段.PCR技术凭借其操作便捷、检测快捷及准确率高等优势,为我国食品行业的发展及国民身体健康奠定保障.因此,PCR技术的应用不仅利于民生基础设施,且利于我国与国际间的贸易发展,具有重要意义.

[关 键 词 ]PCR技术；食品检验；聚合酶；DNA

中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2014）27-0385-01

1.常规PCR检测

常规PCR检测原理是在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液和MgCl2溶液的反应混合物中,在热稳定DNA聚合酶的催化下,对一对寡核苷酸引物所界定的DN段进行扩增.这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火（复性）、延伸等三步反应为一个周期,循环进行,使目标DN段得以扩增.其三个基本反应步骤为：（1）模板DNA的变性模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应做准备；（2）模板DNA与引物的退火（复性）模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；（3）引物的延伸DNA模板―――引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链.这就完成了一个PCR循环,新合成的链都可作为下一次反应的模板,因此扩增产物的量是以指数级方式增加.

2.多重PCR

多重PCR是PCR技术的一种,是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物,同时扩增多个目的基因或DNA序列.首先将双链DNA热变性成单链DNA,然后,人工合成的引物与单链DNA靶序列结合,在4种碱基dNTPs底物存在下,在DNA聚合酶作用下,引物沿着DNA单链从5′末端到3′末端方向延伸,合成新的双链.新合成的双链又作为模板,重复上面的聚合酶反应,合成新的DNA双链,经过20～35个循环扩增出大量拷贝.

2.1 多重PCR的特点

高效性；系统性；经济简便性.

2.2 多重PCR在食品微生物检测中应用

（1）多重PCR在食品病原微生物检测中的应用.食品污染的病原菌主要包括肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌、金葡萄球菌、志贺菌、弯曲菌、单核细胞增生李斯特菌、副溶血性弧菌、耐药球菌等,在检测这些微生物过程中,很容易受到其它微生物和本身变异株的干扰,造成检测阳性和准确率不高的现象.目前,越来越多的研究使用多重PCR检测这些病原菌.（2）多重PCR在食品非致病菌检测中的应用.乳酸菌（LAB）是真空环境下的主要微生物,真空食品包装中的乳酸菌含量一般很低,但它可以在储藏过程中繁殖.采用多重PCR方法检测真装中的微生物对检测食品腐败有重要意义.（3）多重PCR技术在食品微生物检测中存在的问题.多重PCR在食品微生物的检测中可能存在多对引物之间的相互抑制,引物与非靶序列的结合产生非特异性扩增.因此,在多重PCR的应用中,如何合理设计引物,优化最佳多重PCR体系及反应条件可以减少非特异性扩增、检测阴性、检测阳性结果.

2.3 RT-PCR

逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的原理是提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA.再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能.

2.4 巢式PCR

巢式PCR（nestingPCR）是指先后用两套引物进行扩增的PCR技术,用内外两对引物先后扩增靶基因片段.通常是先用第一套引物扩增15～30个循环,再用已扩增的DN段内设定的第二套引物扩增15～30个循环.

2.5 免疫-PCR

免疫-PCR由Sano等首创,是指用DNA分子作为标记物,在做一般的免疫反应的同时进行PCR扩增和电泳分析的免疫试验.在免疫-PCR中,多用生物素作为连接分子.生物素具有两个独立的结合位点,一个可与DNA分子结合,另一个能与抗原2抗体复合物上的亲和素结合,由此将DNA分子和抗原-抗体复合物专一性地连接在一起,形成抗原-抗体-亲和素-生物素-DNA复合物,然后加入PCR扩增系统,标记的DNA便可.

2.6 荧光定量PCR

实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术（FRET）应用于常规多聚酶链式反应仪中,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色团转移到受体发色团,受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比,检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度,从而达到定量目的.

2.7 热起动PCR

热起动PCR指的是使TaqDNA聚合酶只在样品温度超过至少70℃时才发挥作用的PCR.热起动可减少非靶序列的扩增,从而提高反应的特异性.热起动的基本方法是在进行PCR反应之初,将TaqDNA聚合酶、氯化镁和引物这些DNA合成所必需的关键性试剂先不要加入样品管内；而将样品管加热,待温度上升至70℃以上时.再将上述试剂加入,开始PCR反应.

3.结束语

食品安全受到人们的广泛关注.食品在生产、包装、运输、销售等环节都会受到微生物得感染,对微生物的检测是食品安全检测中的一个中要组成部分,PCR技术的广泛使用可以很好的对微生物进行检测,解决人们的食品安全问题.而PCR技术也随着近几年技术的不断进步,不断进行了改进,PCR技术都在食品检验中发挥了重要作用.