微囊藻毒素分子印迹传感器的制备与应用

摘 要 以邻氨基酚为单体,微囊藻毒素（MC-LR）为模板,采用循环伏安法在金电极的表面电聚合成膜分子印迹材料,制备了传感器.采用安培法对MC-LR进行检测.在制备影响条件最佳值（pH＝4.5；单体/模板＝1.4×10.8∶1；洗脱时间 10 min）的基础上,对该传感器的线性范围、使用寿命、选择性等进行了研究,并与液相色谱方法进行对比,结果表明： 该传感器对MC-LR具有良好的选择性和灵敏度,线性范围为0.05～0.35 mg/L；加标回收率为80%～105%；检出限为7.3

SymbolmA@ g/L.与液相色谱方法对比,当置信度为99%时,无系统误差.

关 键 词 微囊藻毒素； 分子印迹； 电聚合； 传感器

2011-06-30收稿；2011-09-21接受

本文系北京市自然科学基金（No.2102015）资助项目

* E-mail：cuilf@th.btbu.省略

1.引 言

微囊藻毒素（Microcystins, MCs） 是一种在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻毒素[1].微囊藻毒素的种类较多,目前发现有大约80种异构体[2],其中含量较多,存在较普遍,毒性较大的是LR, YR和RR,其中L,R和Y分别代表Leu（亮氨酸）、Arg（精氨酸）和Tyr（酪氨酸）.而MC-LR是目前已知的毒性最强、急性危害最大的一种淡水藻类毒素,是最强的肝脏肿瘤促进剂[3].目前.检测水中MCs的常用方法有生物法、生物化学法、生物传感器法、分子信息检测技术、色谱检测技术等[4],这些方法都有各自的不足,如高效液相色谱法预处理过程繁琐,设备昂贵等.Tong等[5]将高灵敏的电化学免疫传感器-单层碳纳米角技术（SWNHs）用于快速检测微囊藻毒素（MC-LR）,并通过拉曼光谱、X衍射光谱、扫描电子显微镜、透射电镜技术进行表征.分子印迹电化学法与此生物传感器法相比,它的制备过程比较简单,无需制备MC-LR抗体；它与天然的识别系统,如酶和底物,抗体和抗原相比,具有抗恶劣环境的能力,表现出高度稳定性和长的使用寿命.

分子印迹技术（MIT）通过分子印迹聚合物（MIPs）对模板分子的“记忆”效应达到对目标分子的特异性选择[6],在分离科学[7,8],传感器技术[9] 和痕量物质富集[10]等方面有广阔的应用前景.而电聚合法制备分子印迹传感器因具有均匀、重现性好、纳米级厚度、制备简单、实验条件要求低等优点.本实验以邻氨基酚为单体,微囊藻毒素（MC-LR）为模板,采用循环伏安法在金电极的表面聚合成膜分子印迹传感器,利用K3Fe（CN）6为印迹电极和底液间的探针,实现了对微囊藻毒素的检测.

2.实验部分

2.1 仪器与试剂

AUT070416型电化学工作站（瑞士万通中国有限公司）；Wsters-1525高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；金电极（φ＝3 mm,天津艾达恒晟科技发展有限公司）；铂电极和饱和甘汞电极（江苏金坛电分析仪器厂）；KQ-400DB数控超声波清洗器（昆山动超声仪器有限公司）.微囊藻毒素MC-LR标准样品（E-LR-C100 Microcystin-LR≥ 95%,台湾）；邻氨基酚（北京理工大学科技开发公司）；K3Fe（CN）6（北京化工厂）； 其余试剂均为分析纯.实验室用水为去离子水.

2.2 金电极的预处理

金电极在0.3

SymbolmA@ m A12O3粉末上抛光成镜面.依次用稀HNO3（1∶1,V/V）,无水乙醇,蒸馏水超声洗涤,每次3 min.在K3Fe（CN）6溶液中,在

Symbolm@@ 0.1～0.6 V电位范围内进行循环伏安法（CV）扫描直至达到稳定,用去离子水洗净待用.

2.3 分子印迹传感器敏感膜的制备

采用三电极体系进行电聚合,金电极为工作电极.以藻毒素（MC-LR）为模板分子,邻氨基酚为功能单体,以0.10 mol/L HClO4溶解0.065 g邻氨基酚,用0.40 mol/L NaOH调节至pH 4.50,加入4.50 mg/L MC-LR溶液.用CV法在

Symbolm@@ 0.2～1.2 V范围内扫描30圈,扫描速度为50 mV/s,平衡时间为10 s.聚合膜沉积在电极的表面,用10 mL甲醇-水（4∶1, V/V）进行超声洗脱10 min,将模板分子从电极上除去,制成留有模板分子构型空穴的分子印迹聚合物薄膜.在同样条件下,与未加模板分子制备的非印迹膜电极进行对比.

2.4 检测方法

采用三电极装置：印迹传感器为工作电极,铂电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极.在室温条件下,将印迹电极浸入到5.00 mmol/L K3Fe（CN）6溶液中,当背景电流达到稳定后,加入MC-LR溶液.采用循环伏安法对印迹传感器进行电化学表征.以示差脉冲法的电流值与MC-LR浓度的关系进行定量测定.

3.结果与讨论

3.1 分子印迹电聚合

聚合过程中,邻氨基酚与藻毒素MC-LR之间发生离子键或氢键的作用.图1为模板分子MC-LR存在下邻氨基酚在金电极上电聚合的循环伏安曲线.由图1可知,此聚合是不可逆的过程,在0.6 V处有一个明显的氧化还原峰,随着循环扫描次数的增加,电流强度急剧下降,这是由于在聚合过程中形成了一层致密的不导电的电聚合膜,从而改变循环伏安响应曲线值.

3.2 分子印迹敏感膜的表征

采用循环伏安法进行电化学表征,并用扫描电镜（SEM）分析.由图2可见,裸电极有明显的氧化还原峰,而未洗脱的印迹电极无氧化还原峰,即电极表面生成了完全不导电的聚合膜.经洗脱后有低于裸电极的峰电流,说明印迹分子MC-LR被洗脱,印迹分子被洗脱以后,印迹膜的表面留有许多不规则的空穴,Fe（CN）3

Symbolm@@ 6通过空穴扩散到电极表面进行氧化还原反应,所以洗脱后的印迹电极氧化还原峰要高于未洗脱的印迹电极.

图1 邻氨基酚（OAP）电聚合过程中的循环伏安曲线

Fig．1 Cyclic voltammograms of O-aminophenol （OAP） electropolymerization procedure

a. 聚合第一圈（The first circle）； b. 余下的圈数（The remaining circle）.

Fig．2 Cyclic voltammograms of different electrodes

a. 裸电极（Bared electrode）； b. 洗脱后的分子印迹膜电极（MIP-modified electrode after remove the imprinting molecules）； c. 洗脱前的分子印迹膜电极（MIP-modified electrode befor remove the imprinting molecules）.

对裸电极及洗脱模板分子前后的分子印迹膜进行扫描电镜（SEM）分析（图3）.裸电极的表面可以看到由于打磨留下的明显划痕（图3A）,聚合后已形成一层平滑聚合膜覆盖在电极的表面（图3B）,聚合膜经洗脱模板分子后膜表面形成了不规则的空穴（图3C）.

Fig．3 SEM photographs of molecular imprinted membrane

A. 裸电极（Bared electrode）, B. 印迹后电极（MIP-modified electrode）； C. 洗脱后电极（Eluted electrode）\.

3.3 聚合条件影响

3.3.1 pH值的影响 邻氨基酚在中性和碱性溶液中得到无活性膜,用循环伏安法在酸性溶液中电聚合,则可得到均匀的活性聚邻氨基酚膜[11].本实验在 pH 2.5～6.5的酸性环境中进行聚合.当pH＝4.5时,洗脱前后的峰电流差值最大,即洗脱下的印迹分子MC-LR最多,说明在此pH条件下印迹效果最好,所以pH＝4.5为本实验的最佳值.实验结果见图4.

3.3.2 单体模板比例的影响 单体与模板的比例较小时,难以形成稳定的印迹点位,过多的模板阻碍了单体间的聚合,不易形成聚合物.单体与模板的比例较大时,容易形成单体之间的直接聚合,导致分子的包埋现象.由图5可知,当单体与模板的质量比为1.4×10.8∶1时,电化学检测的MC-LR的浓度最大.

Fig．4 Influence of pH

Fig．5 Influence of monomer/ template ratio

3.3.3 洗脱时间的影响 由于邻氨基酚膜不溶于甲醇[10],而藻毒素溶于甲醇,所以选取甲醇-水（4∶1,V/V）洗脱.洗脱 图6 洗脱时间影响曲线图

Fig．6 Influence of elution time时间不充分则不能形成有特定吸附点的空穴.实验表明,洗脱时间为10 min时,洗脱下的MC-LR浓度值最大,以后趋于平缓（见图6）.

3.4 传感器的性能指标

3.4.1 线性范围、检出限及使用寿命 应用示差脉冲法研究了传感器在K3Fe（CN）6本底溶液中加入不同浓度的MC-LR后的响应.结果表明,MC-LR浓度在0.05～0.35 mg/L范围内成线性关系,线性方程为y＝51.09x

Symbolm@@ 2.2148,相关系数为0.992.

按照HJ168-2010环境监测分析方法标准对检出限的要求,在相同的分析条件下,重复18次空白试验,计算检出限为7.3

SymbolmA@ g/L.

用连续洗脱的方法检测使用寿命,随着使用次数的增加,传感器的使用寿命逐渐减小,当使用25次时,电极的衰减率已大于30%. 图7 印迹电极在不同被测物中的示差脉冲曲线

Fig．7 Differential pulse curves of imprinted electrode in different solution

a. 5.00 mmol/L K3Fe（CN）.6, b. a＋0.05 g/L D-甘露糖（D-Mannose）, c. a＋0.05 g/L L-组氨酸（L-Histidine）, d. a＋0.3 mg/L MC-RR.

3.4.2 印迹敏感膜的选择性 选取水体中的天然有机物（糖类、氨基酸）和与MC-LR结构相似的MC-RR验证分子印迹膜的特异选择性.测定结果如图7所示,a为印迹电极的峰电流,曲线b、c和d的峰电流明显比e高,说明MC-LR印迹传感器对D-甘露糖和L-组氨酸几乎没有响应,由于MC-RR与MC-LR结构上具有相似性,印迹电极对MC-RR具有较小的响应,所以曲线d的峰电流略低于b和c；而D-甘露糖和L-组氨酸的结构与MC-LR相差较大,与印迹空穴不匹配,因而不能封闭空穴,Fe（CN）3

Symbolm@@ 6扩散不受阻碍,导致电极对加入干扰物后的K3Fe（CN）6溶液的峰电流与印迹电极峰电流几乎没变化,因此印迹电极对两者未显示特异选择性.

3.4.3 分子印迹传感器方法与液相色谱方法性能分析对比 取MC-LR的标准溶液分别用高效液相色谱法和电化学分子印迹方法进行检测,并对数据进行系统误差检验,结果见表1.

经计算,F计算＝2.66,置信度为95％,查F分布表（单边）,F（0.025,4,4）＝9.60,F计算＜ F（0.025,4,4）,则说明这两种方法实验结果精密度不存在系统误差.查t分布表,得t（0.01,8）＝3.66,t（0.05,8） ＝ 2.31,计算得t计算＝2.84.t计算＜t（0.01,8）,当置信度为99%时,电化学分子印迹方法与高效液相色谱方法在准确度上不存在系统误差；t计算＞t（0.05,8）,所以置信度为95%时,存在系统误差.说明印迹传感器和HPLC测定的结果具有可比性,此传感器可快速检测富营养化水体中的MC-LR.

3.5 实际水样分析

取3种实验室自培养的富营养水体,定量加入K3Fe（CN）6,配制成5.00 mmol/L K3Fe（CN）6溶液,分别用制备好的分子印迹传感器检测MC-LR的含量,分析MC-LR浓度各3次,取其平均值,实验结果和方法的加标回收率见表2, 结果令人满意.

References

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Preparation and Application of Microcystins

Sensor Based on Molecular Imprinting

SHEN Qing.1, CUI Li-Feng*1, ZHAO Shuo.2, LI Ke.1

.1（Food institute, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China）

.2（Qinggong College, Hebei United University, Tangshan 603000, China）

Abstract A molecularly imprinted film sensor was prepared by cyclic voltammetry on a gold electrode surface using O-aminophenol as the monomer, microcystin （MC-LR） as a template, and then MC-LR was determined by amperometry. The optimum preparation conditions for the sensor were as follows: pH＝4.5, monomer/template＝1.4×10.8∶1, elution time＝10 min. The characteristics of the sensor such as the linear relationship, service life, selectivity were investigated. Experimental results showed that the linear response of the sensor is 0.05－0.35 mg/L, the recovery of standard addition is 80% to 105% and the detection limit is 7.3

SymbolmA@ g/L. In parison with HPLC, when the confidence level was 99%, there is no systematic error. The sensor exhibited a good selectivity and sensitivity

Keywords Microcystins, Molecular imprinting, Electricity polymerization, Sensor

（Received 30 June 2011, accepted 21 September 2011）

热分析与量热仪及其应用

（第二版,ISBN 978-7-122-09689-0）