网站原创摘 要 ：初步研究了花生细胞悬浮培养过程.比较了不同基本培养基、接种量和激素对悬浮培养过程中细胞生长量的影响.
关 键 词 ：花生愈伤组织；悬浮细胞；接种量
中图分类号：S56文献标识码：A文章编号：1671-1297（2008）08-141-01
一、前言
悬浮细胞的培养过程要求比较严格,一般2―3天转代一次,转代时的无菌操作必须小心谨慎,避免因外界原因使培养基染菌.但在花生各个培养过程中,均产生不同程度的褐变现象,导致细胞分裂和生长受到制约,本实验就基本培养基、接种量对悬浮培养过程中细胞生长量的影响作了测定和分析.
二、 材料与方法
(一)材料
选取生长旺盛、结构疏松、状态相似的花生愈伤组织,作为细胞悬浮培养的材料.
(二)方法
1.基本培养基、接种量对细胞悬浮培养的影响
选取3 种液体培养基MS、B5、ER ,均加入1.00 mg/ L 22 ,4-D、0.5 mg/ L KT ,水解乳蛋白50 mg/ L、葡萄糖20 g/ L ,考察不同培养基对花生细胞生长的影响.接种量分别选取0.5、1. 0、3. 0、5. 0 g ,以B5 为基本培养基,附加1. 0 mg/ L 2 ,4-D、0. 5 mg/ L KT、水解乳蛋白50 mg/ L、葡萄糖20 g/ L ,以考察接种量对花生细胞生长情况的影响.两者培养条件均为pH 值5. 8 ,24 ℃,摇床转速为100 rpm/ min 暗培养.
2.植物激素的调控
以B5 为基本培养基,葡萄糖20 g/ L ,pH 值调至5. 8 ,接种量为3 g ,2 ,4-D 分别取0. 5、1. 0、3. 0、5. 0 mg/ L 4 个水平,KT 分别取0. 1、0. 5 mg/ L 2个水平.
3.花生悬浮细胞生长曲线的测定
在150 mL的三角瓶先加入20 mL 液体培养基,每瓶接种愈伤组织1. 0 g ,放置在摇床上,24 ℃黑暗状态下进行振荡培养,转速为110 rpm/ min.3 d 后每瓶加入成分相同的新鲜培养基至60 ml .每3 d 测1 次鲜、干重,重复3 次.15 d 后收获悬浮培养细胞,继代培养时用无菌的尼龙网细胞筛过滤,弃去较大的细胞团,选择1 mm 大小的细胞团约1 g 加入60 mL 新鲜培养液重新进行振荡培养.
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4.实验数据的测定方法：悬浮培养细胞鲜、干重的测定
①测量烘干至恒重的滤纸；②将滤纸用水浸湿,称量滤纸湿重； ③取出细胞液倒入放置滤纸的漏斗里,过滤,并抽滤多余水分,称量鲜细胞和湿滤纸的质量； ④把细胞和滤纸同时放到60 ℃烘箱中至恒重,称量干细胞和干滤纸的质量.每隔2 d测量1 次,每次3 个重复.细胞鲜重等于 鲜细胞和湿滤纸的质量―湿滤纸的质量；细胞干重等于 干细胞和干滤纸的质量―干滤纸的质量.
三、结果与分析
实验表明在细胞悬浮培养中,2,4-D 一般有利于细胞的生长,这与试验结果相符.但2,4-D 添加过多会导致严重的褐变.故2,4-D 范围选择在0.5～3.0 mg/ L .细胞分裂素选取KT ,范围为0.05～0.4 mg/ L.