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脑源性神经营养因子对小鼠回肠及结肠平滑肌收缩活动的影响及其机制

陈飞雪,于岩波,王鹏,左秀丽,李延青

(山东大学齐鲁医院消化内科,济南250012)

摘 要:目的观察不同浓度脑源性神经营养因子(BDNF)对小鼠离体回肠和结肠平滑肌肌条收缩活动的影响,探讨蛋白酪氨酸TrkB)-磷脂酶C(PLC)/三磷酸肌醇(IP3)信号通路在BDNF影响肠道平滑肌收缩过程中的作用.方法制备小鼠回肠,近端结肠和远端结肠平滑肌纵肌条观察不同浓度BDNF(1×10-81×10-7mol/L)对小鼠离体肠道肌条收缩活性的影响,并分别观察TrkB抗体,新霉素及肝素种TrkB-PLC/IP3信号通路阻滞剂孵育肌条后,BDNF对肌条收缩活动的影响.结果BDNF(1×10-81×10-7mol/L)对小鼠回肠和结肠平滑肌离体肌条的收缩具有明显的兴奋效应,(P<,0.05).TrkB抗体新霉素及肝素明显BDNF(1×10-7mol/L)对肌条收缩的兴奋作用,其张力效应值与对照组相比均有统计学意义(P<,0.05).结论BDNF兴奋小鼠肠道平滑肌肌条的收缩活动TrkB-PLC/IP3信号通路在BDNF影响肠动力过程中发挥重要作用关 键 词脑源性神经营养因子,信号通路,平滑肌,收缩,小鼠中图分类号:R574文献标码:ABrain-derivedneurotrophicfactorinfluencescontractileactivityintheisolatedileumandcolonofmice

CHENFei-xue,YUYan-bo,WANGPeng,ZUOXiu-li,LIYan-qing

(DepartmentofGastroenterology,QiluHospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China)

Abstract:ObjectiveToelucidatethedirecteffectsofbrain-derivedneurotrophicfactor(BDNF)oncontractionofmiceintestinalmusclestripsandtoinvestigatewhethertheeffectofBDNFonintestinalcontractioniediatedthroughthetyrosinekinasereceptorB(TrkB)-phospholipaseC(PLC)/inositoltriphosphate(IP3)pathway.MethodsLongitudinalmuscle(LM)stripsofileum,proximalcolonanddistalcolonfromC57bl/6micewereprepared.ThecontractionofLMwasrecordedwithtensiontransducer.ToinvestigatethecontractileeffectsofBDNFonLMstrips,twodifferentdosesofBDNF(1×10-8and1×10-7mol/L)wereaddedtothemusclestrips.ToinvestigatetheeffectsofantagonistsofTrkB-PLC/IP3signalpathwayonthecontractionofmusclestripsinducedbyBDNF,LMstripswerepretreatedwithTrkB(1×10-8mol/L),neomycin(1×10-5mol/L)andheparin(1×10-5mol/L)beforeadministrationofBDNF.ResultsBDNFexcitedthecontractionofLMfrommiceileum,proximalcolonanddistalcolon(P<,0.05)ofmice.PretreatmentwithTrkB(1×10-8mol/L),neomycin(1×10-5mol/L)andheparin(1×10-5mol/L)dramaticallyattenuatedtheexcitatoryeffectsofBDNF(10-7mol/L)onthecontractionsofLMstrips(P<,0.05).ConclusionBDNFexcitesthecontractionofmiceintestinalmusclestrips,andtheantagonistsofTrkB-PLC/IP3signalpathwayattenuatestheexcitatoryeffectsofBDNF,whichhighlightstheimportantroleofBDNFandTrkB-PLC/IP3signalpathwayinpromotingthegutmotility.

Keywords:Brain-derivedneurotrophicfactor,Signalpathway,Smoothmuscle,Contraction,Mice

作为神经营养物质家族中的一员,脑源性神经营养因子(rain-derivedneurotrophicfactor,BDNF)对肠道感觉的调节作用已被大量研究,近年发现其对肠道动力亦发挥着重要的调节作用.临床研究表明BDNF可以加快健康成人或外周神经病变患者的肠道排空增加排便频率[1-],在调节肠道动力过程中发挥着重要的作用,但目前尚BDNF对肠动力调节作用系统性研究.在中枢神经系统,BDNF与蛋白酪氨tyrosinekinasereceptorB,TrkB)结合后激活磷脂酶C(phospholipaseCPLC)/三磷酸肌醇(nositoltriphosphate,IP3)信号传导途径进而使胞内的钙离子浓度升高,增强神经肌肉接头突触兴奋性神经传导[-5],提示BDNF可能通过与中枢作用相似的机制,发挥其对肠动力的调节作用.本研究运用离体平滑肌肌条动力测定技术,观察不同浓度BDNF对小鼠离体回肠和结肠平滑肌肌条收缩活动的影响TrkB-PLC/IP3信号通路在BDNF影响肠道平滑肌收缩过程中的作用.实验动物健康成年雄性C57Bl/6小鼠40只,体20～25g,由山东大学医学院神经生物学研究所提供.

BDNF购于美国Peprotech公司抗-TrkB抗体购自美国Sigma公司新霉素(PLC阻滞剂)和肝素(IP3阻滞剂)购自山东大学齐鲁医院.以上试剂均溶于0.9%的生理盐水溶液中.Kreb's液组成:NaCl120.6KCl5.9,MgCl21.2,CaCl22.5,KH2PO41.2,NaHCO315.4,D-glucose11.5.每次实验前用蒸馏水新鲜配制持续供给95%O2和5%CO2的混合气体pH保持在7.14.主要仪器设备ZH-Z离体器官测量系统(淮北正华生物仪器设备有限公司)JH-2B张力换能器(北京航天医学工程研究所)麦氏(Magnus)浴槽及UP-PC生物信号处理系统(上海嘉龙教学仪器厂)离体肌条制备小鼠禁食不禁水12h,颈椎脱臼处死,开腹,迅速取出近端结肠约2cm,远端结肠约2cm(距肛门0.5cm)和回肠约2cm,放置于4℃Kerb's液中.沿肠系膜剪开肠管,小心去除黏膜,与肠管平行方向取纵肌肌条(8mm×3mm).将各肌条分别置于灌流肌槽中,每个肌槽均盛有5m37℃Kerb's液并持续供给95%O2和5%CO2的混合气体.肌条的一端固定在肌槽底部的玻璃挂钩上,另一端连接张力换能器,通过生物信号处理系统记录和分析肌肉收缩活动的张力变化.对肌条施加0.5g预初张力,平衡3040min(每隔10min用新鲜37℃Kerb's液冲洗肌条),以肌条自发性收缩稳定时为平衡标准.实验步骤①BDNF对小鼠肠道平滑肌肌条的作用:以为空白对照,待为1×10-8mol/L和1×10-7mol/L,每种浓度观察记录20min.更换BDNF浓度前先用37℃Kerb's液冲洗肌条3次,每次间隔10min,待肌条自发收缩恢复到原来平衡状态后,再加下一药物②TrkB-PLC/IP3信号通路阻滞剂对BDNF作用的影响:以BDNF(1×10-7mol/L)为对照待肌条平衡后分别向不同的灌流槽中加入TrkB抗体10μL,新霉素15μL及肝素12μL,使其终浓度分别为1×10-8mol/L,1×10-5mol/L及1×10-5mol/L.TrkB抗体孵育肌条60min后加入BDNF(1×10-7mol/L)新霉素肝素分别孵育肌条20min后加入BDNF(1×10-7mol/L),观察记录20min.

观察指标取加入BDNF前10min的肌条运动的平均张力为基础值,加入BDNF后20min内的平均张力为效应值(R即BDNF加入前后肌条收缩振幅的变化程度),R作为BDNF对肌条运动影响的指标.

1.3统计学处理采用SPSS16.0软件进行统计分析,数据以表示采用组间各浓度的差异t检验比较同一浓度不同预处理的差异P<,0.05为差异有统计学意义.不同浓度BDNF对小鼠回肠和结肠平滑肌肌条收缩活动的影响回肠肌条与空白对照组比较,1×10-8mol/LBDNF可以增强肌条的收缩振幅,(1.06±0.031.00±0.01,P>,0.05).1×10-7mol/LBDNF对肌条的收缩有明显的兴奋效应,与对照组比较差别有意义(1.±0.07vs1.00±0.01,P<,0.05).

2.1.2近端结肠肌条与对照组比较,1×10-8mol/LBDNF肌条的收缩R值从1.00±0.0增加到1.±0.03(P>,0.05),但差异无统计学意义.1×10-7mol/LBDNF肌条的收缩R值从1.00±0.0增加到1.3±0.06(P>,0.05),见图2.

远端结肠肌条与对照组比较,1×10-8-1×10-7mol/LBDNF(1.9±0.04vs1.00±0.02,P>,0.05).1×10-7mol/LBDNF对肌条的收缩有明显的兴奋效应,与对照组比较差别有意义(1.±0.05vs1.00±0.02,P<,0.05).

图1BDNF(1×10-7mol/L)加入前,后小鼠回肠,近端结肠和远端结肠平滑肌肌条收缩活动的实时记录曲线.

A:回肠,B:近端结肠,C:远端结肠.

Fig.1Real-timedepictedcurvesofthelongitudinalmuscle(LM)stripcontractionofileum,proximalcolonanddistalcolonbeforeandafterBDNFwasadministrated(1×10-7mol/L).

A:Ileum,B:Proximalcolon,C:Distalcolon.

图2BDNF对小鼠回肠,近端结肠和远端结肠平滑肌肌条收缩兴奋效应的量效曲线.*P<,0.05vs对照组.

Fig.2SummarydataoftheexcitatoryeffectofBDNFonileum,proximalcolonanddistalcolonLMstrips.

*P<,0.05vsthecontrolgroup.

表1小鼠回肠及结肠对BDNF反应的张力效应值(R)

BDNF浓度(mol/L)1.00±0.011.00±0.011.00±0.021×10-81.06±0.031.07±0.031.09±0.041×10-71.29±0.07*1.33±0.06*1.39±0.05**P<,0.05vs对照组.

2.2TrkB-PLC/IP3信号通路对BDNF兴奋肌条效应的影响TrkB抗体组预先给予TrkB抗体(1×10-8mol/L)孵育回肠和远端结肠平滑肌肌条60min,再加入BDNF(1×10-7mol/L),肌条收缩张力效应值分别1.02±0.03(回肠肌条)和1.0±0.03(远端结肠肌条),与单独应用BDNF(1×10-7mol/L)后的R值(回肠肌条1.±0.07,远端结肠肌条1.±0.05),差有统计学意义(P<,0.05).

PLC阻滞剂新霉素组预先给予新霉素(1×10-5mol/L)孵育回肠和远端结肠平滑肌肌条20min,再加入BDNF(1×10-7mol/L),肌条收缩张力效应值分别1.04±0.05(回肠肌条)和1.0±0.04(远端结肠肌条),与单独应用BDNF(1×10-7mol/L)后的R值(同上),差有统计学意义(P<,0.05).

IP3阻滞剂肝素组预先给予肝素(1×10-5mol/L)孵育回肠和远端结肠平滑肌肌条20min,再加入BDNF(1×10-7mol/L),肌条收缩张力效应值分别1.05±0.04(回肠肌条)和1.0±0.05(远端结肠肌条),与单独应用BDNF(1×10-7mol/L)后的R值(同上),差有统计学意义(P<,0.05).新霉素BDNF(1×10-7mol/L)兴奋*P<,0.05vs单独应用BDNF(1×10-7mol/L)组.

Fig.3TheroleofTrkB-Ab,neomycinandheparinintheexcitatoryeffectofBDNF(1×10-7mol/L)ontheLMstripsofileumanddistalcoloninmice.

A:Ileum,B:Distalcolon.*P<,0.05vsthegrouptreatedonlywithBDNF(1×10-7mol/L).

3讨论

BDNF广泛分布于中枢和外周神经系统,在神经元分化,发育,存活中发挥重要作用.近来研究发现,BDNF不仅在神经系统而且在肠道各层亦有大量表达,包括肠神经系统,肠膜上皮和肠肌层,并有研究显示其在肠道的表达量甚至超过在脑中的表达量[-7],提示BDNF在肠道发挥着重要的生理调节功能.已有研究证实BDNF在肠神经元可塑性调节及肠道感觉调节中发挥重要作用[-10],但关于BDNF在肠动力调节方面的.

对1000余例各种神经紊乱患者应用重组人类脑源性神经营养因子r-metHuBDNF)进行治疗,发现其对肠道运动功能有加速作用,所有患者均出现了剂量依赖性腹泻的副作用,在对肌萎缩性侧索硬化症患者应用r-metHuBDNF进行治疗时,患者也出现了腹泻的症状[],提示r-metHuBDNF可使大便在结肠通过时问缩短,大便次数增加.Coulie等[]在人体研究发现,r-metHuBDNF可以加快健康人群结肠运输功能,增加大便次数.Wellmer等[]在对糖尿病多发神经病患者应用r-metHuBDNF治疗时,发现患者的肠道运动功能增强.Grider等[1]研究发现BDNF可以增强由膜刺激引起的大鼠离体结肠蠕动反射,而BDNF+/-小鼠结肠的蠕动反射明显减弱研究发现BDNF明显增强大鼠肠道平滑肌的肌电活动[1].以上研究均说明BDNF在调节肠动力方面发挥了重要作用但BDNF对肠道平滑肌收缩的具体调节作用及其机制报道.

本研究检测不同浓度BDNF对肠道肌条收缩活动的影响,结果显示BDNF增加小鼠回肠,近端结肠和远端结肠肌条的收缩幅度表明BDNF可以兴奋回肠和结肠平滑肌肌条的收缩活性,发挥促进肠道动力作用与前述的BDNF促进人和大鼠肠道动力作用的研究结果一致.

目前关于BDNF促进肠道动力作用的潜在机制尚未阐明.在中枢神经系统,BDNF与TrkB受体结合后,受体分子二聚化,其多个酪氨酸残基快速自动磷酸化,这些活化的蛋白质可以通过激活三种信号通路来发挥其生物学功能.其中TrkB-P/Akt及TrkB-MEK/MAPK信号通路主要在神经元的分化,发育,存活和突触可塑性调节方面发挥作用[13-15].TrkB-PLC/IP3信号,可使胞内的钙离子浓度升高,升高的钙离子与其相应的受体结合进而引起下游的系列反应突触囊泡的释放离子通道的开放等从而发挥生物学效应例如参与LTP的形成[1],调节各型离子通道增强神经肌肉接头突触兴奋性神经传导[].Boeans等[1]研究发现,TrkB受体向培养的鼠肠肌间神经丛加入外源性BDNF,发现可以增强突触囊泡簇的密度并且易化突触囊泡内兴奋性神经递质的释放,增强由5-TH和SP引起的肠神经元内Ca2+流量BDNF在肠神经系统TrkB-PLC/IP3信号发挥重要的动力调节作用.本研究TrkB抗体TrkB-PLC/IP3信号,检测BDNF(1×10-7mol/L)引起的的肠道肌条收缩活动的影响,明显BDNF(1×10-7mol/L)对小鼠回肠和远端结肠肌条收缩的兴奋作用.本研究结果表明TrkB-PLC/IP3信号综上所述,本实验验证了BDNF对小鼠肠道肌条的兴奋作用,发现TrkB-PLC/IP3信号通路阻滞剂可明显减弱BDNF对肠道肌条的兴奋作用表明BDNF及其下游的TrkB-PLC/IP3信号通路在促进肠动力过程中发挥着不可或缺的作用.随着对BDNF促肠动力机制研究的深入,BDNF.TheBDNFStudyGroup.AcontrolledtrialofrebinantmethionylhumanBDNFinALS:theBDNFStudyGroup(phaseIII)[J].Neurology,1999,52(7):1427-1433.

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基金项目:国家自然科学基金资助项目(81170352).

作者简介:陈飞雪(1985-),女,硕士研究生,主要从事胃肠动力学研究.E-mail:chenfeixueok@126.

通讯作者:左秀丽(1968-),女,博士,副主任医师,主要从事胃肠动力学研究.E-mail:xiulizuo@gmail.

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