P24在HIV感染者和艾滋病患者检测中的应用

关 键 词：艾滋病；P24抗原；窗口期；免疫复合物

中图分类号：R512.91

文献标识码：A

文章编号：1007-2349（2011）10-0028-03

获得性免疫缺陷综合征（AcquiredImmunoDeficiencySyndrome）简称艾滋病（AIDS）,是由人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus,HIV）感染机体所引起的一种严重的传染性疾病.目前该疾病已从在高危人群传播逐步转化为在一般人群传播,因此艾滋病的预防与控制成为医务和研究工作的重要部分.对HIV感染的检测方法包括抗体检测、P24抗原检测、核酸检测以及CD4+T淋巴细胞水平检测等［1］.机体感染HIV后,P24抗原是较早能从血清中检出的病原学标志,感染后约2～3周即可检出,1～2个月左右进入抗原高峰,然后随着机体抗体的逐渐产生,由于抗体的中和作用,形成抗原抗体复合物,而游离性抗原很少,甚至会低于监测水平,机体进入无症状感染期.疾病后期,随着病毒的复制增强,免疫系统逐渐破坏,P24抗原水平会再次提高作为HIV活动性感染的标志.而HIV抗体的检测存在一个窗口期,一般平均为2～3个月,但95%以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后6个月以内［2］.P24抗原在血清抗体阳转前2d～18d即可检测到,因此HIV-1P24抗原检测可作为HIV抗体检测窗口期的辅助诊断［3］,也可检测疾病进展、进行药物疗效评估等.

1P24的组成特点

P24抗原是HIV的主要结构蛋白,在病毒的包装和成熟过程中起重要作用,缺失P24病毒将无法正常组装.HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷病毒组,为球形颗粒,直径约100~120nm.典型的HIV-1由核心和包膜两部分组成,核心包括两条正股RNA链、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类,病毒复制所必须的酶类包括逆转录酶（P51,P66）、整合酶（P32）和蛋白酶（P11）.核心外面为病毒衣壳蛋白（P24、P17）.病毒的最外层为包膜,其中嵌有gp120和gp41两种特异性糖蛋白.HIV基因全长约9.8kb,含有3个结构基因（gag、pol和env）、2个调节基因（tat反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节子）和4个辅助基因（负调控因子、病毒r蛋白、病毒u蛋白和毒粒感染性因子）.在HIV病毒3个结构基因中,env的变异率最高,gag和pol比较保守.P24蛋白是gag基因编码55kD的前体蛋白经pol基因编码的蛋白酶的加工后产生的,因此P24蛋白氨基酸顺序在HIV各病毒株之间高度保守,使P24在HIV-1感染的检测中有一定的实用价值.

2P24的临床应用

P24抗原检测技术是常用的HIV抗原检测.在下面几种情况中具有重要的作用.

2.1HIV感染早期抗体出现前的一段时期称为窗口期,处于窗口期的艾滋病病毒感染者血液中虽检测不到抗体,但血液、、分泌物、乳汁等体液中含有艾滋病病毒而具传染性.在此期间：血清HIV抗体阴性,可检测到病毒RNA和病毒衣壳蛋白P24抗原,还有变化的CD4+T淋巴细胞水平.P24抗原检测是HIV早期感染检测的重要手段.在HIV抗体检测中,遇到2种初筛试验均为阳性或一阴一阳而WB阴性时,不能轻易报告阴性,尤其是近期有高危行为者或有急性流感样症状者.为排除窗口期的可能,可以进行HIV-1P24抗原或HIV核酸检测,并于2~3个月后复查抗体,以减少漏检率.

2.2监测病程进展和预后的判断病毒蛋白P24抗原的增加与病毒的复制相平行.当P24抗原浓度再次在血清中升高,意味着病毒的大量繁殖和免疫系统的破坏,提示感染者进入或即将进入艾滋病期.监测P24浓度变化可以反映病情进展,为控制和治疗艾滋病提供试验依据.

2.3HIV抗体不确定P24抗原是HIV确证试验蛋白印迹法（WB）试剂条带中的重要组成部分.WB法HIV-1抗体阳性：检测出两条env带（gp160/gp41和gp120）及gag带（P17、P24、P55）或Pol带（P31、P51、P66）.WB法中,条带P66和P24,检出率较高,可作为常见的反应抗原,特别是P24抗原,检出率达100%.有研究［4］表明,没有HIV感染危险的献血员发生WB不确定结果的频率大于20%,主要是针对P17和P24的反应.另有研究［5］指出,在没有HIV感染的人群中,HIV-1的P24抗体阳性率分别是：健康人群0.67%,普通患者13%,表皮T细胞淋巴瘤患者24%,孕妇0.1%.这些结果显示：HIV抗体不确定结果比较常见.不确定结果绝大多数是非特异性反应,一般可能与血清标本的加热、高胆红素水平、溶血、类风湿因子、系统性红斑狼疮、多次输血或使用血液制品等因素有关,还可能与HIV病毒抗原与宿主细胞成分的相互交叉反应有关,也与受检者个人的生活环境有紧密关系.

2.4鉴定新生儿感染,预测母婴垂直传播的可能性HIV阳性孕妇所产下的婴儿体内可能含有来自母体的抗体,抗体检测易出现检测阳性.而P24抗原检测可用于鉴定婴儿是否感染,在HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的诊断中与RNA检测相当,与HIV核酸检测具有可比性,具有重要的实用价值.

2.5药物疗效评价随着技术的进展,检测灵敏度不断提高,P24抗原的检测逐渐从主要用于窗口期辅助诊断,发展到用于临床疗效评价.我国HIV感染者和艾滋病患者大部分是在基层且分布广,病毒载量检测费用高,对仪器和操作人员要求也高,很难在基层普及,很大地阻碍了疾病的控制.P24抗原检测成本低、操作简单,易于普及.

24抗原的检测

HIV-1P24抗原检测主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫荧光分析技术（IFA）等技术.其中酶联免疫吸附试验（ELISA）测定P24抗原技术是检测HIV感染最敏感的方法.其原理是用已知抗体包被固相载体,加入待测血清,若血清中含有P24抗原则与抗体结合形成抗原抗体复合物,再加入酶标记抗体与抗原结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体复合物,加底物显色,在酶标仪读取结果.此法易受干扰物质影响产生检测阳性,因此需用中和试验加以验证.由于HIV-1感染者P24抗原含量少且在病情发展过程中形成抗原抗体复合物影响P24抗原检出,另外方法灵敏度低,使P24抗原在HIV感染诊断中与病毒核酸检测相比没有优势.近年来,新的抗原检测方法大幅度提高了检测灵敏度［6］,主要有以下几种.

3.1免疫复合物裂解检测法（ICD）该法是用酸、碱处理或加热的方法使抗原抗体复合物分离,从而增加P24抗原的浓度,提高P24检测的敏感性和阳性检出率,热处理方法比酸碱处理方法更能提高P24的阳性检出率.一般认为P24-ICD的检测敏感性为90%［7］.

3.2超敏感酶免疫测定法（UEI）该法是利用高亲和力抗体浓缩富集血清中的P24抗原,然后进行检测P24.该法敏感性好,特异性强,检测阀值为0.24pg／mL,并且与HIV抗体的ELISA检测相比,可提前12~20d检测到P24抗原.

3.3免疫吸附电镜法（ISEM）该法是将抗原与抗体的特异性与电子显微镜的高分辨力相结合,实现对病毒颗粒或病毒可溶性抗原的直接特异性检测,灵敏度高,但需要精密仪器,操作较复杂.

3.4线性免疫酶测定（LIA）是第4代HIV抗原检测技术［8］,具有较好的敏感性,缩短了检测窗口期3～6d,特异性高达99.84%,检测阈值为0.01pg/mL.

3.5荧光联结抗原定量法（FLAQ）该法是将抗P24／P27单克隆抗体包被的聚苯乙烯微球与待测样品、荧光标记物的抗P24／P27以及裂解液混合后孵育,再借助流式细胞仪直接测定单个微球上的荧光强度,不需洗去未结合的检测抗体,再做出标准曲线对P24／P27抗原进行定量分析［9］.该方法操作简单,实用性强,检测限为0.1～100ng／mL.

4P24抗原的应用总结

在人体感染HIV后的10～14d内,病毒RNA水平是呈指数上升,之后下降并保持在持续稳定的水平,机体进入HIV无症状期［10］.P24抗原水平随着病毒RNA水平的发展而发展,在急性感染期就可出现,被认为是病毒复制的间接性标志.P24的氨基酸序列高度保守,临床检测稳定,其出现又早于抗体,可作为HIV早期感染的重要指标,是窗口期的主要检测手段之一.P24的常规检测方法是ELISA,新的灵敏度高的方法主要有免疫复合物裂解检测法（ICD）、超敏感酶免疫测定法（UEI）、免疫吸附电镜法（ISEM）和线性免疫酶测定（LIA）.用高灵敏度的P24检测方法诊断艾滋病将有助于疾病早期诊断,避免漏检,同时可对治疗艾滋病药物进行疗效评估、判断预后和监测疾病进程,也在预防母婴垂直传播和抗体不确定等方面有一定用途,并已应用在第四代艾滋病检测的ELISA试剂盒中,临床价值较大.2004年来自美国马里兰大学的Dr.Gallo［11］的实验室的1篇有关高灵敏度检测P24抗原的研究综述指出：P24抗原检测方法的灵敏度得以大幅提高,并认为这可以作为低成本、适合在发展中国家使用的替代昂贵的RNA测定方法的一种方法.目前P24抗原的检测灵敏度仍较低,还不能完全替代病毒RNA测定.进一步提高检测的灵敏性,是P24诊断方法改进和试剂开发的主要方向.

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（收稿日期：2011-06-17）