一起学校B型流感暴发的实验室检测

【摘 要】目的了解南平地区浦城县一起流感暴发疫情,通过实验室检测分析确定病原,为今后有效开展流感实验室工作提供依据.方法通过流行病学调查,结合荧光定量PCR快速诊断检测和流感病毒分离实验室检测进行综合分析.结果荧光定量PCR快速诊断检测8例病人咽拭子,阳性8例,均为B型,阳性率为100%.流感病毒分离鉴定检测8例,第一次培养7例阳性,分离率由87.5%（7/8）.只有1份为阴性,将阴性标本做第二次重培养,才出现阳性,均为B型（Victoria系）,病毒培养分离率上升为100%（8/8）.结论本起流感疫情共发病76例,罹患率为10.8%（76/706）.我们采集病人咽拭子,进行荧光定量PCR快速诊断检测和细胞培养分离流感病毒鉴定,确定为B型维多利亚株引起.此次疫情结合荧光定量PCR和细胞培养分离病毒的方法,用核酸快速检测结果指导细胞培养分离病毒,提高了阳性检出率.较传统方法大大保证了检测的时效性,而对基层疫情确定及时有效处理控制发挥了重要的指导意义.

【关 键 词】流感；暴发；实验室检测

2012年春季,南平地区浦城县某学校发生集体性发热事件,经流行病学调查,结合临床表现判断为疑似流感暴发.为确定引起暴发的病原,以便为采取有针对性防治措施提供依据,我们采集病人咽拭子,进行荧光定量PCR快速诊断检测和细胞培养分离流感病毒,现将疫情调查处理情况和实验室检测进行分析如下：

1.流行病学调查

1.1发病情况

2012年2月1-18日,浦城县某学校发生以发热、咳嗽、咽痛、流涕等为主要症状的流感样疫情,全校共706人,共发病76例,罹患率10.8%（76/706）.其中确诊病例8例,临床诊断病例68例.首发病例患者于2月6日出现发热（T39℃）,咳嗽、咽痛、流涕、喷嚏伴腹泻,末例到6月17日,发病高峰时间在2月12日-2月14日,占全部病例数的73%.2月14日下午学校采取调课措施后,病例迅速下降,2月16省市疾控调查组介入调查,至18日已无新病例出现.疫情得到有效控制.

1.2临床表现

主要为发烧（76例均有发热其中3例超过40℃）、咳嗽（76例）、流涕（53例）、咽痛（48例）、头痛（32例）.76例病例中,大部分病例临床症状普遍轻微,均居家进行治疗,病程一般为3～5天左右,患者均无肺炎等并发症,无住院病例.

2.实验室检测

2.1材料

2.1.1标本采集由浦城县CDC用DMEM液采集典型病例咽拭子8人份.冷藏保存送到实验室,进行荧光定量PCR快速检测和病毒分离,不能立即分离的置一75℃保存.

2.1.2标准血清A/天津津南/15/2009（H1N1）、A/福建同安/196/2009（H3N2）、A/四川/SWL1/2009、B/重庆渝中/1384/2010（Victoria）、B/四川安岳/139/2011（Yamagata）由国家流感中心提供.

2.1.3MDCK细胞培养：用常规胰酶消化细胞传代,DMEM培养液含1O%小牛血清.

2.1.41.5%人红血球悬液：用Alsever氏血球保存人红血球.用前以PH7.4的PBS洗3次（前2次1200r/min离心5min,末次经1200r/min离心lOmin）,最后用PBS配成1.5%浓度.

2.1.5六孔塑料板、2O～200移液器.

2.1.6荧光定量RT-PCR快速诊断试剂：QIAampViralRNAMiniKit试剂盒（QIAGEN公司）,荧光PCR法甲型和乙型流感病毒核酸测定试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司）.

2.2方法

2.2.1荧光定量RT-PCR快速诊断检测使用QIAampViralRNAMiniKit试剂盒（QIAGEN公司）,提取病毒核酸后,采用甲型和乙型流感病毒核酸测定试剂盒（上海之江生物科技股份有限公司）,进行荧光定量PCR扩增检测.

2.2.2流感病毒分离采用组织培养技术,按《2011流感监测技术指南》将传代狗肾细胞（MDCKcells）经胰酶消化后分铺细胞六孔板上,细胞长成单层后,每份标本接种2个细胞孔,在35℃含5%二氧化碳培养箱培养,7d后收集细胞液,用1.5%新鲜人“0”型红细胞作血凝（HA）试验,作为初筛[1].HA阳性标本用国家流感中心提供的标准血清A/天津津南/15/2009（H1N1）、A/福建同安/196/2009（H3N2）、A/四川/SWL1/2009、B/重庆渝中/1384/2010（Victoria）、B/四川安岳/139/2011（Yamagata）做红细胞凝集抑制试验（HAI）,进行型别鉴定[1].

3结果

3.1流感病毒分离培养

采集的8份咽拭子接种MDCK细胞培养.将细胞病变的（CPE）培养液用1.5%人红血球做血凝试验.第一次传代编号为NP120109～116,血凝效价分别为1：16,1：32,l：16,1：32,1：16,阴性,l：32,l：32.第二次传代编号NP1201114血凝效价为1：32见表1.

3.2病毒分型鉴定

用标准血清A/天津津南/15/2009（H1N1）、A/福建同安/196/2009（H3N2）、A/四川/SWL1/2009、B/重庆渝中/1384/2010（Victoria）、B/四川安岳/139/2011（Yamagata）对分离的8株流感病毒进行分型鉴定.结果与B/重庆渝中/1384/2010（Victoria）凝集效价均为﹥l：1280,与其他凝集效价均

4讨论

4.1根据流行病学调查,结合荧光定量RT-PCR快速诊断及病毒分离,经标准血清和人“0”型血球鉴定,确定浦城县某学校发生流感爆发疫情,是由B型维多利亚毒株导致.从2011年8月开始至2012年南平地区一直是B型流感病毒在流行.由于学生未接种疫苗抗体水平低下,造成局部暴发流行.提醒我们加强学校流感疫苗接种和流感监测工作,防治流感大流行.

4.2首发病例2月6日出现后由于卫生室按一般的感冒治疗.未引起重视而没有隔离治疗,导致全校76人发病,罹患率为10.8%（76/706）.2月14日经过卫生院疫情报告后,浦城市疾病预防控制中心采取有效的防治措施使疫情在短期内得到控制.

4.3流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,冬春季节多引起暴发疫情,其临床症状与普通感冒等疾病相似,经典的实验室诊断采用接种鸡胚与狗肾传代细胞（MDCK）进行病毒分离进行疫情判断,但由于这些检测方法的检测周期较长,有可能会贻误疫情的控制.近年来逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）和实时荧光定量逆转录一聚合酶链反应（realtimeRT—PCR）等方法被用于流感病毒的快速检测,大大保证了检测的时效性[2-3].由于流感在症状上与普通感冒难以鉴别,因此流感快速检测对基层疫情处理有重要指导意义.而进一步明确病毒株种类又是区别A型、B型流感的主要方法,目前甲型H1N1流感是全球关注的重点传染病,明确诊断可避免社会上引起不必要的恐慌[4].此次疫情结合荧光定量PCR和细胞培养分离病毒的方法,用荧光定量RT-PCR快速诊断8份咽拭子阳性率100%,指导在用MDCK细胞分离流感病毒的方法时,提升培养阳性率使二者结果一致.荧光定量RT-PCR阳性而病毒分离为阴性,其原因是多方面的,可能是荧光定量RT-PCR更敏感一些,也可能是由于PCR扩增产物污染而产生的检测阳性[5],还有就细胞分离流感病毒未培养好,这是需进一步探讨.而长期以来,一直缺乏对流感快速准确的诊断方法,与传统的病毒培养相比较,我们采用的荧光定量RT—PCR快速诊断,具有灵敏度高,特异性强,所需时间短的优点,为疑似流感暴发疫情的实验室应急诊断提供了一种快速有效的检测手段.