基因治疗在口腔再生医学领域中的进展

颌面部的创伤、炎症、肿瘤、先天性畸形等均可造成牙齿、牙周组织、颌骨等口腔颌面部组织器官的缺损.现有的修复手段均存在一定的局限性,难以完全满足临床需要.1995年,Baum[1]首次描述了基因治疗在口腔领域的应用前景.十六年来,随着分子生物学、基因重组技术、再生生物学等基础学科的迅猛发展,基因治疗技术在口腔再生医学领域的应用取得了较好的研究进展,已经成为国际口腔生物学和转化医学研究关注的热点问题[2-6].因此,本文将对基因转移技术以及基因治疗在口腔再生医学临床应用的最新进展综述如下.

1基因治疗的途径和常用载体

基因治疗技术,一种新的治疗策略在口腔再生医学领域中的应用发展迅速.基因治疗通常采用两种途径,体外间接基因治疗(exvivo)和体内直接基因治疗(invivo)[3,6].无论间接还是直接基因转移都需要借助载体才能将外源基因转入靶细胞内.目前载体系统主要分为病毒和非病毒两种[3],常用的病毒载体有腺病毒（）,腺相关病毒（A）,逆转录病毒（RV,包括慢病毒载体）,单纯疱疹病毒（HSV）,杂合病毒等[7-9].非病毒性载体有裸DNA、脂质体与脂质体复合物、纳米颗粒等[3].

2基因治疗在口腔再生医学中的应用

2.1颌面骨组织再生：用于治疗颌骨缺损的靶基因很多,作用机制和环节不尽相同,目前的研究主要集中于骨形成蛋白(bonemorphogeicprotein,BMP)基因.Park等[10]应用脂质体和腺病毒载体分别将BMP-2基因导入大鼠骨髓基质细胞(BMSC,bonemarrowstromalcells),比较了两种载体的体外、体内成骨能力.体外实验结果显示腺病毒组的转染效率是脂质体组的两倍.当将基因修饰细胞复合明胶海绵植入大鼠下颌骨的骨缺损区,BMP-2可以在体内表达2周以上,促进了下颌骨骨缺损的修复,其中腺病毒组4周后骨缺损几乎完全愈合,而脂质体组相对新骨形成速度较慢,6周后骨缺损基本愈合,阴性对照组8周时仍未见骨愈合.Zhao等[11]用腺病毒介导的BMP-2转染BMSC细胞,结合磷酸三钙支架材料可以修复下颌骨的缺损,获得矿化密度较高的新生骨.Chang等[12]应用腺病毒载体携带BMP-2,体外修饰BMSC,并植入小型猪的上颌骨缺损区,实验组的骨缺损在3个月后完全修复,组织学观察显示新生骨为成熟的编织骨且钙化良好.近期,Ke等[8]应用安全性较好的A病毒载体介导BMP-2体外修饰BMSC,并将其植入兔子的上颌骨缺损,颌骨缺损的修复能力显著提高.Ashinoff等[13]研究通过腺病毒介导的BMP-2对大鼠下颌骨牵张成骨的影响.实验结果表明,实验组在牵张成骨部位新骨形成量显著增加.

BMP基因治疗在促进颌骨组织再生中的应用非常广泛,近来也有一些研究报道了其他治疗基因的应用,例如碱性成纤维生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF）,音波刺猬因子（sonichedgehog,SHH）等.Jiang等[14]将腺病毒介导的bFGF基因修饰的骨髓基质干细胞移植入兔子下颌骨牵张成骨区域,可以有效地促进更多的新骨形成.Edward等[15]将逆转录病毒介导的Shh修饰的三种细胞(牙龈纤维细胞、间充质干细胞、脂肪来源细胞)复合I型胶原植入兔的颅骨缺损处,6周后通过X线片、组织学观察,骨组织缺损区域几乎完全修复,同时机体没有出现任何不良反应.

颌骨的生长调控需要多因子的协同作用,多个治疗基因的联合应用也取得了一定进展.Koh等[16]的研究证实通过基因治疗的同时表达两种成骨因子BMP2和BMP7,表现出了更强的骨组织再生能力.通过X线片,MicroCT和组织学切片进行检测,4周后BMP2和BMP7的联合基因转染组,其成骨能力显著高于单个基因转染组,表现为颅骨缺损区域几乎完全修复,甚至个别缺损区的成骨量更致密,显著高于阴性对照组.另外,将促血管生成因子与成骨因子联合应用,可以更好地协同促进颌骨组织再生.Peng等[17]的研究表明单独应用VEGF并不能促进骨的再生,但是将VEGF和BMP4基因共同修饰MDSC,并与明胶海绵共同植入小鼠的颅骨缺损区域后,血管新生和新骨形成能力显著增强.

2.2颞下颌关节组织再生：颞下颌关节的组织工程需要促进功能性骨和软骨组织再生,并需要建立适当的骨-软骨交界区.Schek等[18-19]将分化的猪软骨细胞和Ad.BMP7基因修饰的人牙龈纤维细胞复合到生物支架中,并将复合物移植到免疫缺陷小鼠的皮下,4周后构建了一种骨-软骨组织,包括血管化骨,成熟的软骨以及清晰的矿化界面.另一项研究进展是将基因直接导入下颌髁突,1999年,Kuboki等[20]用腺病毒载体携带B-半乳糖苷酶基因直接体内法注射到豚鼠颞下颌关节上腔,4周后发现,关节软骨表面和滑膜均有B-半乳糖苷酶的稳定表达,从而证明了腺病毒介导基因治疗颞下颌关节疾病的可行性.Rabie等[21]用A病毒载体介导了治疗基因VEGF感染了大鼠的髁突组织,体内试验证明VEGF的表达增强,促进了下颌髁突的软骨内成骨进程.Li等[22]用A病毒载体携带Vastatin基因,局部注射到颞下颌关节后区,进一步证明转基因不仅表达在髁突软骨,而且在关节盘和关节窝都有持续的表达.这些研究为生理性骨-软骨结构的构建以及TMJ局部基因治疗的应用前景提供了实验依据.

2.3牙周组织再生：牙周病造成牙周支持组织破坏及牙周附着丧失,是导致牙齿缺失的最主要原因.牙周病治疗的目的不仅在于控制炎症,更在于使已经破坏的牙周组织再生以形成新附着.牙周组织再生包括因炎症破坏吸收的硬组织(牙槽骨与牙骨质)和软组织(牙周膜与牙龈).Jin等[23]将携带血小板衍生生长因子-B（plateletderivedgrowthfactor-B,PDGF-B）的腺病毒直接注射于牙周缺损处,结果显示,病毒感染组牙槽骨的修复4倍于对照组,而牙骨质的修复则6倍于对照组,提示应用PDGF-B基因治疗可以促进牙周的修复潜能.Chang等[24]的进一步研究证实在牙周骨缺损处直接局部注射腺病毒介导的PDGF-B是安全可靠的,没有发现治疗引起的机体不良反应.尽管2周内在缺损局部可以检测到病毒载体的DNA,随着时间的推移病毒载体的量逐渐衰减.可见PDGF-B基因转染可有效地促进细胞增殖和缺损的充填,证实了基因转入牙周细胞可以为牙周再生提供一个便捷的途径.

2.4牙体组织再生：牙再生的研究是口腔再生医学研究中最为活跃的领域.Rutherford等[25]采用了体外间接基因转染方式,将携带BMP-7的腺病毒载体感染培养的成体纤维细胞,然后将修饰后的细胞与胶原复合植入白鼬炎性牙髓组织中,研究发现BMP-7的基因转染促进了修复性牙本质的形成.Nakashima等[26-27]用电穿孔（Electroporation）的方法将分化因子（Gdf1）转染到培养的小鼠牙髓细胞中可以在体外促进其向成牙本质细胞转化.Nakashima等[28]又用超声波的方法转染Gdf1,发现它还可以促进犬的自体牙髓干细胞分化为成牙本质细胞,同时在犬的模型上修复性牙本质的形成增加,其中管状牙本质的再生最为明显.可见,通过转染特异性基因和生长因子进入成体牙细胞,为促进组织工程牙的形态发生提供了新的思路.

3基因治疗的前景展望

成功的基因治疗必须包括选择适当的治疗基因、适当的转导,使其在体内获得安全、持续和可调控的表达.口腔再生医学领域的基因治疗,虽然在动物试验上取得了一些初步经验,但是离真正的临床推广应用还有相当长的一段距离.将来的研究将着眼于以下几个方面：①对于目的基因,仍需进一步明确何种基因或多种基因的联合应用；②选择与构建一个安全、高效、可调控的甚至是具有组织特异性的靶向基因载体仍是基因治疗面临的重要问题；③在基因转导方法上仍需决定最佳基因载体或者靶细胞的数量、最佳转入体内的时机,以及减少不良反应以达到最佳治疗效果.随着现代分子生物技术日趋成熟和基因工程研究的深入,相信这些问题在不远的将来都会得到解决.

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[收稿日期]2011-06-07[修回日期]2011-08-01

编辑/李阳利