生物溶菌酶其在药用医学上的应用

溶菌酶(Lysozyme,法定编号:EC3.2.1.17,美国化学文摘怎么写作社(CAS)编号[9066-59-5])又称胞壁质酶或N-乙酰胞质聚糖水解酶,是一种安全性很高,且具有一定保健作用的蛋白酶.它广泛存在于鸟类、家禽的蛋清中和哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘以及体液、组织细胞内,其中以蛋清中含量最丰富(约0.3%).在一些植物体如卷心菜、萝卜、无花果和微生物体内也存在溶菌酶,溶菌酶能选择性地分解微生物及植物细胞壁,对人体细胞不会产生降解作用,常作为绿色天然防腐剂被广泛应用于食品、医药等行业.WHO(WorldHealthOrganization)及许多国家都公认溶菌酶的无毒性,并核准其可作为治疗性物质在一些食品中使用[1].

1溶菌酶的理化性质[2]

溶菌酶是一种糖苷水解酶,干燥条件下可在室温长期保存,其纯品为白色或微白色结晶型或无定型粉末,无臭、味甜、易溶于水,不溶于丙酮、等.化学性质非常稳定,对热也极为稳定在酸性环境中,溶菌酶对热的稳定性很强,在pH值4～7范围内,100℃处理1min仍能保持原酶活性.但在碱性环境中该酶对热稳定性较差.最适pH值为6.6,作用的最适温度为45～50℃,等电点pH等于10.5～11.

2溶菌酶的主要来源

2.1动物源溶菌酶

动物源溶菌酶包括鸡蛋清溶菌酶及人和哺乳动物溶菌酶.鸡蛋清溶菌酶是目前研究和应用最多的,最适效应温度在50℃,化学性质稳定,PH在4~7范围内100℃处理1min,仍有近100%的活力,在210℃条件下加热1.5h仍具有活性,在碱性环境条件下稳定性较差,可分解G+细菌,但对G-细菌不起作用.研究表明其它鸟类蛋清溶菌酶也是由129个氨基酸残基组成.对于哺乳动物溶菌酶,目前仅从牛、马、羊等动物的乳汁中分离出溶菌酶,其化学性质与人溶菌酶相似,但结构尚不清楚,其溶菌活性远低于人溶菌酶.

2.2植物源溶菌酶

目前发现含溶菌酶的植物有近170种.在木瓜、无花果,大麦等植物中均已分离出溶菌酶.植物源溶菌酶分子量较大,约为24000-29000单位,其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋清溶菌酶的1/3,但其对胶体状甲壳质的分解活性则是鸡蛋清溶菌酶的10倍.

2.3微生物源溶菌酶

微生物产生的溶菌酶可分为7类：蛋白酶与内肽酶,酰胺酶,N-乙酰己糖胺酶,ß,-1,3、ß,-1,6葡聚糖酶、甘露糖酶,

壳聚糖酶,磷酸甘露糖酶,脱乙酰壳多糖酶.

3溶菌酶的抑菌作用[3]

溶菌酶是一种碱性蛋白,相对分子量为14.6×103,它的一级结构由129个氨基酸残基组成2200个原子,其稳定性主要与多级结构中的4对二硫键、氢键及疏水键有关,而且它通过其肽键上的第35位的谷氨酸和第52位的天冬氨酸构成的活性部位水解破坏组成微生物细胞壁的N-乙酰氨基葡糖（NAG）-N乙酰氨基葡糖乳酸（NAM）间的B-1,4糖苷键,使革兰氏阳性菌体细胞壁不溶性多糖水解生成可溶性粘肽,是一种具有杀菌作用的天然抗感染物质.

3.1对细菌的作用

3.1.1对变形链球菌的作用[4]

现代龋病学广泛认为,变形链球菌与龋齿的发生、发展密切相关.变形链球菌能发酵糖类产酸,能在很低的pH值环境下生存,引起牙体硬组织脱矿.变形链球菌所合成的细胞外葡聚糖有利于细菌的附着和聚集于牙面获得性膜表面,更有利于细菌对牙面的破坏.溶菌酶是人唾液中重要的抗菌成分,以两种形式存在于唾液:一种是自由型,一种是与阴离子蛋白和多糖构成可逆的复合物.溶菌酶在腺体分泌物和全唾液中的浓度范围为2～80μg•,mL.具有抗体非依赖性防御功能,其抗菌活性通过以下途径:聚集细菌、导致菌胞解链、妨碍胞内代谢和改变细胞通透性,以致抑菌、溶菌和杀菌.Kirstila等[5]用田鼠实验感染S.mutans建立模型,再用含溶菌酶的软膏涂布于牙齿表面,与空白对照组比较,发现溶菌酶防龋有明显效果.

3.1.2对金葡萄球菌的作用[6]

金葡萄球菌是烧伤创面感染的主要菌株之一,近年来感染发生率不断上升.因此,有效的控制创面感染是烧伤治疗成败的关键.复合溶菌酶能特异性溶解金葡萄球菌,它的核心成分溶葡萄球菌酶是一种含锌的金属蛋白酶,专一降解金葡萄球菌细胞壁肽聚糖成分中的甘氨酸肽键,迅速杀死金葡萄球菌等细胞壁中具有甘氨酸肽键结构的细菌,对MRSA及中间型抗万古霉素金葡萄球菌有特效.复合溶菌酶是纯生物制剂,不易产生耐药性,无毒副作用,对皮肤粘膜也无任何刺激.Climo[7]等曾先后介绍了复合溶菌酶对MRSA感染的主动脉心内膜炎有很好的治疗效果,指出复合溶菌酶控制烧伤感染有较好的疗效.

3.1.3对有益菌的作用

溶菌酶对常见的3种有益菌（乳酸杆菌、双枝杆菌、腊孢杆菌）48ug/ml浓度抑菌无效果.溶菌酶在婴儿体内可以直接或间接促进婴儿肠道细菌双歧乳酸杆菌的增值,促进婴儿消化吸收,可以促进人工喂养婴儿肠道细菌的正常化；能够加强血清灭菌蛋白（Properdin）,r-球蛋白（r-globulin）等体内防御因子对感染的抵抗力,特别对早产婴儿有防御体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效.

3.2对真菌的作用

皮肤癣多由真菌引起.溶菌酶裂解细菌细胞壁肽聚糖骨架乙酰葡糖胺与乙酰胞壁酸分子间连接的β-1,4糖苷键破坏细胞壁,使其通透性增强而产生溶菌.由于真菌细胞壁主要成分由β-1,4糖苷键连接的多糖组成,在溶菌酶作用后,β-1,4糖苷键裂解,细胞壁破坏,通透性增强,致细胞内容物外漏或细胞膨大裂解,或抑制细胞出芽繁殖.溶菌酶对絮状表皮癣菌和石膏样小孢子癣菌有明显抑菌作用,表明溶菌酶对丝状真菌有抗真菌作用.黄真[8]（2006）在对皮肤癣菌的抑菌作用观察中将絮状表皮癣菌、石膏样小孢子癣菌的沙保琼脂培养物分别加入4ml不同浓度的溶菌酶生理盐水中,结果显示:对照组与经8mg/ml溶菌酶处理的两种实验菌接种物有菌生长繁殖形成丝状菌落,经10mg/ml、20mg/ml、40mg/ml溶菌酶处理的接种物均无菌生长繁殖形成菌落.这一结果证实了溶菌酶对絮状表皮癣菌、石膏样小孢子癣菌有抑菌作用.但笔者认为真菌细胞壁结构复杂,溶菌酶抗真菌作用的机制仅是依据溶菌酶抗细菌机制进行的一种推论,确切机制有待进一步研究.

3．3对病毒的作用

由于溶菌酶是碱性蛋白质,在体内近于中性的pH环境下带有大量正电荷,可与带负电荷的病毒蛋白直接作用,和DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使侵入体内的病毒失活,从理论上说应该对冠状病毒有作用,所以溶菌酶可能对艾滋病病毒和SARS病毒有效.

1983年,Prakash等报道[9]在包皮下湿处发现含有溶菌酶,Laumann等[10]对美国77例包皮环切术的成年男子进行研究,结果表明:这些包皮环切术的男子没有包皮下湿处,也没有溶菌酶保护,所以很容易被细菌和病毒感染.世界卫生组织资料[11]也表明:美国受到HIV感染的机会比其它国家多出4倍,甚至更多.做过包皮环切术的丈夫对于怀孕妇女来说,是HIV感染的危险因素.Grosskurth等发现[12],在坦桑尼亚包皮环切术男子更容易感染HIV.日本东北大学的水文雄教授[14]采集了2至40岁的22名健康人唾液样品,各与0.5毫升含艾滋病病毒的唾液混合,在37℃保温1h,结果发现其中17件样品有99%的艾滋病病毒已被破坏,进一步研究发现这是唾液溶菌酶起的作用.研究结果表明溶菌酶具有有效的抗HIV感染的效果.

2002年11月在我国广东省流行一种“非典型肺炎”,世界卫生组织(WHO)认为非典型肺炎是一种冠状病毒亚型变种所致.于是有人用溶菌酶联合激素、抗生素及抗病物对3例确诊轻症和5例疑似非典型肺炎进行研究,结果表明溶菌酶可能是一种安全的辅助抗SARS治疗药物.在被疱疹病毒感染的Hela细胞培养液中,加溶菌酶后有抑制细胞变性作用,溶菌酶也可抑制腺病毒生长,可用于带状疱疹、腮腺炎、鸡水痘、肝炎及流感等病毒性疾患的治疗[13].

4展望

基于溶菌酶在医学各个领域发挥越来越深刻的影响,其应用具有广阔前景,因此将目光转向扩大筛选的范围,向大自然索取新型的生物活性溶菌酶,是新药研究的最新选择.开发溶菌酶来源,进行胞外生产或与基因工程技术相结合,较容易实现大规模工业化生产,进而获得更高效、更加安全的新型药物,造福人类.

[6]李罗珠于益鹏陈玉林复合溶菌酶在烧伤创面感染中的临床应用[J]中华烧伤杂志2002,4：225

[7]ClimoMW,PatronRL,GoldsteinBP,etal.Lysostaphintreatmentofexperimentalmethicillin2resistantStaphylocciusaureusaorticvalveendocardits.Antimicrob2Agents2Chemother,1998,42:1355.

[8]黄真,张文平,王小丽等溶菌酶对皮肤癣菌抑菌作用的观察赣南医学院学报2006,4：492-493

[9]PrakashS,RaoR,VenkatesanK,etal.Sub-reputialwetnessanditsnature[J]AnnNatMedSci,1982(18):109-112.

[10]LaumannEO,MasiCM,ZuckermanEW.CircumcisionintheUnitedStates:prevalence,prophylacticeffects,andsexualpratice[J].JAMA,1997,277:1052-1057.

[11]WorldHealthOrganization.TheCurrentSituationoftheHIV/AIDSPandemic,QuarterlyReport[J].WorldHealthOrganization,Geneva:July3,1995.

[12]GrosskurthH.,MoshaF,ToddJ,etal.Amunitytri-aloftheimpactofimprovedsexuallytranitteddiseasetreatmentontheHIVepidemicinruralTanzania:2.Base-linesurveyresults[J].AIDS,1995,9(8):927-934.

[13]JohnsonLN.Theearlyhistoryoflysozyme[J].NatureStructuralBiology,1998,5(11):942-944.