高效液相色谱法概

[摘 要]本文综述了高效液相色谱法与其他色谱法相比下所具有的优点、分类、应用、缺点及发展前景.

[关 键 词]高效液相色谱法；优点；应用；缺点；前景

[中图分类号]R927[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2008）08（a）-028-02

GeneralityofHPLC

ZHANGJian-hong,CHENYou-sheng

(DepartmentofPharmacy,GuangdongFoodandDrugVocationalCollege,Guangzhou510520,China)

[Abstract]Thispapersummarizestheadvantages,disadvantages,types,applicationsandforegroundofHPLC

[Keywords]HPLC,Advantage,Application,Disadvantage,Foreground

高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography,HPLC)是利用高压输液泵驱使流动相通过装填固定相的色谱柱,按照固液相之间的分配机制对混合物进行分离的方法.

1高效液相色谱法具有的优点

与其他谱法相比具有以下优点：①高分离率(应用10μm以下规则均匀的极细颗粒为固定相,所以传质阻抗小,柱效高,一般在1×103~5×105n/m)；②高速(采用2×103~3×104kPa的高压输液泵输送液体流动相,使其具有高流速,数分钟至几十分钟可完成试样分析)；③自动化操作,重复性高；④高效相色谱柱可反复使用；⑤高灵敏度(广泛使用了高灵敏检测器,只需要试样10-7~10-2g).

2高效液相色谱法分类

高效液相色谱法按照分离机制可分为以下4种：

2.1液-液分配色谱法（liquid-liquidchromatography)

LLC根据流动相和固定相的极性不同又可分为,①正向LLC：流动相极性<固定相极性,极性小的组分先流出色谱柱,适合极性物质分离.②反向LLC：流动相极性>固定相极性,极性大的组分先流出色谱柱,适合非极性物质分离.

理论上应不相溶的固定相和流动相,实际上仍有少量微量固定相溶解,并且机械冲击作用也会导致固定相流失,从而使柱的分离效率和选择性降低,目前主要采用化学键合固定相(即通过固定相的有机基团与载体（硅胶）表面的游离羟基发生化学反应,从而使固定相与载体键合起来)来克服这一问题.

2.2液-固吸附色谱法（liquid-solidadsorptionchromatogramphy）

在吸附色谱中,组分分子和流动相分子对吸附剂（固定相）表面产生竞争性吸附,利用组分和固定相吸附力的不同而分离.

2.3离子交换色谱法(ionexchangechromatography)

离子交换剂上可解离的离子与流动相中组分离子进行可逆的离子交换,利用试样中不同组分与离子交换剂具有不同的亲和力而将它们分离的方法.

2.4空间排阻色谱法（凝胶色谱法）

试样中分子量大小不同的组分进入凝胶柱时,组分分子渗入微孔的程度不同,大分子直接从间隙中越过,首先出柱,分子越小,进入微孔越深,保留值越大,溶剂分子通常最小,最后流出.主要用来分离高分子化合物,如蛋白质、多糖等.

3高效液相色谱法的应用

HPLC已成为应用最为广泛和有效的分离分析手段,应用非常广泛,目前,HPLC在医药、生化、天然产物主要成分的分析、食品分析、环境分析等方面都有广泛的用途：

3.1医药方面

广泛用于药物的分离、分析、定量等[1-3].

3.1.1药物合成的分离精制在药物合成反应中,作为人工合成药物的精制手段,用于除去少量杂质,特别是那些异构体的分离.值得提出的是,药物中R-型和S-型的光学异构体具有不同的生理作用.为了研究药物的作用机制,需要拆分光学异构体(即对映体),这是很困难的工作,而高效液相色谱在这方面显示了独特的长处.利用不同类型的手性固定相与对映体能生成稳定性不同的非对映异构体,从而达到分离目的.

3.1.2天然产物的分离分析天然产物的组分非常复杂,例如中草药等,用高效液相色谱法进行分离分析,具有简单快速的特点.

3.2在生命科学中的应用[4,5]

其在生化领域的应用主要集中于两个方面：①低分子量物质,如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇等的分离和测定.②高分子量物质,如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定.过去对这些生物大分子的分离主要依赖于等速电泳、经典离子交换色谱等技术,但都有一定的局限性,远远不能满足生物化学研究的需要.因为在生化领域中经常要求从复杂的混合物基质,如培养基、发酵液、体液、组织中对感兴趣的物质进行有效而又特异的分离,通常要求检测限达ng级或pg级,或pmol,fmol,并要求重复性好、快速、自动检测；制备分离、回收率高且不失活.在这些方面,HPLC具有明显的优势.

3.3食品方面[6-8]

高效液相色谱法已经被广泛应用于下面二个领域：①食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等；②食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等；③食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃等.

3.4环境分析方面[9]

在对大气中污染物的成分分析,废水、废汽和汽车尾气中有害组分的分析中,高效液相色谱法发挥着很大的作用.

3.5农业方面[10]

在农业的发展中,高效液相色谱也发挥着很大的作用.它主要用来对各种农作物中营养成分进行分析,特别是对多糖、脂肪酸、蛋白质等分析都是极为有效的方法.

4高效液相色谱法存在的问题

4.1涡流扩散（Eddydiffusion）

流动相碰到较大的固体颗粒,就像流水碰到石头一样产生涡流.如果柱装填得不均匀,有的部分松散或有细沟,则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流速就慢,多条流路有快有慢,就使区带变宽.因此,固相载体的颗粒要小而均匀,装柱要松紧均一,这样涡流扩散小,柱效率高.

4.2分子扩散（Moleculardiffusion）

分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动,也称纵向分子扩散.要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱.同时在操作时,如果流速太慢,被分离物质停留时间长,则扩散严重.

4.3质量转移（Masstraner）

被分离物质要在流动相与固定相中平衡,这样才能形成较窄的区带.在液相色谱中,溶质分子要在两个液相之间进行分配,或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间.当流速快时,转移速度慢,来不及达到平衡流动相就向前移,产生物质的非平衡移动,使区带变宽.

4.4流动相流速

当流速太低时,分子扩散严重.如将理论塔板高度对流速作图,理论塔板高度随流速增加而急速下降,当达到最低值时,流速再加大则质量转移起主要作用,理论塔板高度又加大.在高效液相色谱中,流速稍快影响不大,但在凝胶过滤色谱中,因为物质要渗透到凝胶内部,所以质量转移影响大,流速加大会降低柱效率.

4.5固定相颗粒大小

固定相颗粒越小柱效率越高,对流动相流动的阻力越大,需要加大压力才能使它流动.

5展望

高效液相色谱法虽存在上述不足之处,但由于分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、检测自动化、适用范围广、组分易回收、样品处理较简单等优点,从而在医药、食品、生化、环境分析等领域还是有着广泛的应用前景.

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（收稿日期：2008-03-05）