酶抑制率法农残速测技术常见问题探究

摘 要：酶抑制法因其较高的专一性、灵敏性、准确性及低成本等优点,成为农贸集市农产品市场、蔬菜生产基地、各大超市以及各地检测站广泛使用的农药残留检测技术.本文对酶抑制法农残速测技术的原理、操作方法、注意事项及常见问题进行初步探讨.

关 键 词：酶抑制法；农药残留；速测技术

中图分类号：S481.8文献标识码：A

随着人民生活水平的不断提高,食品安全日益得到社会的关注,农残检测技术显得越来越重要.由于气相色谱、液相色谱,以及气质、液质联用等检测技术在应用中存在检测时间长、检测成本较高、检测人员需要较高的技术要求等问题,目前,在我国众多的农药残留快速检测技术中应用最为广泛是酶抑制法,它具有较高的灵敏性,准确度高,专一性强,并以较低的检测成本被农贸市场、大型超市及农产品生产基地所接受.本文对酶抑制率法农残速测技术的原理、操作方法及注意事项、应用中出现的问题进行探究.

1酶抑制法的原理

酶抑制法就是利用昆虫毒理学中昆虫的神经中枢及周围的神经系统中的乙酰胆碱酶在蔬菜中的有机磷类和氨基甲酸酯类农药的作用下,丧失活性,从而导致昆虫体内乙酰胆碱的积累致死的原理来检测农药残留的方法.例如,在蔬菜检测中,蔬菜中不含有有机磷类或氨基甲酸酯类农药或者含有量较小,那么在往蔬菜提取液中加入酶试剂时,酶的活性就没有被抑制,从而能够分解加入的基质,基质水解后的产物便能与显色剂反应产生颜色变化.反之,农药残留量较大,便会抑制酶对基质的水解,于是,显色剂就颜色变化小或者不变色.可以使用分光光度计来测定检测中反应前后吸光度变化的情况来计算出抑制率,从而判断蔬菜中氨基甲酸酯类和有机磷类农药的残留情况.

2酶抑制法检测的操作步骤及注意事项

2.1制备检测试剂

2.1.1配制缓冲液

用百分之一电子天平准确称取无水磷酸氢二钾11.90g、磷酸二氢钾3.20g于烧杯中,加入1000mL蒸馏水用玻璃棒搅拌溶解.

2.1.2配制乙酰胆碱酶

根据酶的活性,用配制的缓冲液溶解调配,控制3min空白对照吸光度变化值△A0在0.3以上,摇匀保存在4℃环境下,最长保存时间不得超过4d.

2.1.3配制底物

用万分之一电子天平准确称取硫代乙酰胆碱25.00mg,溶解于3.0mL蒸馏水中,摇匀保存在4℃环境下,最长保存时间不得超过14d.

2.1.4配制显色剂

用万分之一电子天平准确称取碳酸氢钠15.60mg、二硫代二硝基苯甲酸160.00mg,溶解于20mL缓冲液中,摇匀保存在4℃环境下.

2.2处理待测样品

随机选取蔬菜样品,用干净抹布擦拭掉表面泥土,切成1cm大小,用百分之一电子天平称取样品1.00g放入锥形瓶中,向瓶内加入5mL缓冲液,振荡提取2min,用滤纸过滤提取液,待用.

2.3测试空白对照吸光度变化值

分别向5mL试剂瓶中加入2.5mL缓冲液、0.1mL乙酰胆碱酶试剂、0.1mL显色剂,将其摇匀后放置于37℃环境培养15min以上,拿出后再加入0.1mL底物摇匀,倒入比色皿中,迅速转移至分光光度计测定3min内反应的空白对照吸光度变化值△A0.

2.4测试样品吸光度变化值

将测试空白对照吸光度变化值步骤中加入的缓冲换为2.5mL提取液,其他步骤相同,测定出3min内反应的样品吸光度变化值△At.

2.5计算测定结果

抑制率（%）等于[（△A0-△At）/△A0]×100

2.6结果判定

通过计算得出的抑制率大于50%时,检测样品即为阳性结果,表示蔬菜中氨基甲酸酯类或有机磷类农药的残留量较高.

2.7注意事项

缓冲液即要提取蔬菜中的有毒有害物质,同时也是乙酰胆碱酶,显色剂的配制试剂,所以在配制过程中应对其进行校正,使缓冲液的pH值在8.0.

乙酰胆碱酶、显色剂、底物等均易变质失效,特别是乙酰胆碱酶在检测过程中起着关键作用,它的活性、浓度、纯度等都对检测结果产生较大影响,要掌握并控制好可能造成影响的因素,从而保证检测的灵敏度、准确度和重现性.

在选择样品时要随机取样,使检测样品具有代表性,选取的叶菜应去掉枯叶、烂叶；瓜果类应取表皮1～2cm处,果肉不要取过多；含叶绿素或其他色素较高的蔬菜容易使提取液颜色变深,产生絮状物,影响检测结果,在处理这类样品时应取样后放置氧化10min后再提取.

在培养环节应严格控制温度和时间,培养环境设定在37℃～41℃,培养时间15～30min.

3酶抑制法操作中常出现的问题及应对措施

3.1空白吸光度变化值偏小

先让检测仪器预热30min,保证其具有良好稳定性.把对照样品从培养箱中取出后加入底物应立即转移至仪器中,迅速测定变化值,尽量减少操作时间,否则,测定结果偏小.

3.2样品吸光度偏高

由于乙酰胆碱酶失效或是活性较低,或是样品本身颜色较深,或是反应中基质发生化学、物理变化的干扰,使检测光线被额外的吸收或是被散射,从而使透光率减小,样品的吸光度表现增大.所以,在操作过程中确保酶的活性,提取液要清澈,有干扰的物质要先去除干扰.

3.3样品抑制率为负值

主要是由于操作人员的技术熟练度不够造成的.乙酰胆碱酶在与显色剂、底物反应的过程较快,检测人员稍耽搁或不熟练从而造成人为误差,导致结果为负值.所以,检测人员应加强操作练习,保证操作步骤顺畅,特别是空白对照和样品检测的操作节奏保持一致.

3.4检测结果检测阴性

除了在提取中的人为失误外,某些农药与乙酰胆碱酶的作用很小或是无作用,造成检测结果为阴性的检测象.这是由于本方法的检测局限性造成的,需要判断含何种农药,从而使用其他方法进行检测.

酶抑制法速测技术是在操作实践中不断得到发展的,本文只是笔者在工作实践中的经验之谈,不当之处敬请各位专家同仁批评指正,共同探究此项速测技术,提高检测数据的准确性,不断地完善农药残留的快速检测技术,力求把残毒超标的蔬菜、水果堵在食用之前.