贝母类药材湖北贝母Fritillariahupehensis系统位置的――来自ITS,rpl16,matK序列的证据

[摘 要 ]湖北贝母为传统中药,然而《Flora of China》将其基原植物湖北贝母Fritillaria hupehensis归并于天目贝母F.monantha项下.该实验采用分子系统学方法,以川百合Lilium didii为外类群,用核基因ITS序列和叶绿体基因rpl16序列、matK序列等3个片段对湖北贝母及其近缘类群天目贝母F.monantha、安徽贝母F. anhuiensis等进行联合建树分析,对湖北贝母植物的系统位置进行了探讨,为湖北贝母药材的安全使用提供分子证据.结果显示,分子系统树上,3种贝母各自的居群聚为一支,之后天目贝母与安徽贝母聚为一支,最后与湖北贝母聚为一支.表明湖北贝母与天目贝母的亲缘关系可能要远于安徽贝母与天目贝母之间的关系,因此不适宜将湖北贝母归并于天目贝母.

[关 键 词 ]湖北贝母； 天目贝母； 安徽贝母； ITS； rpl16； matK

贝母为我国传统中药,具有清热化痰,止咳散结的功效,2010年版《中国药典》[1]中记载了5个品种的贝母类药材,分别是川贝母、浙贝母、湖北贝母、伊贝母和平贝母,涵盖了贝母属植物10种1变种.贝母属植物主要分布于北半球的温带地区,全世界130多种,中国有20多种,除《中国药典》记载的种类外,在中国民间,其余贝母属物种也多作为贝母类药材的代用品使用.然而,由于形态性状变异复杂,加之可能存在的种间杂交[2-3],使得该属,特别是东亚地区物种分类处理并不十分清晰,这直接导致了药材使用上的不便,如药材湖北贝母的基原植物湖北贝母Fritillaria hupehensis为《中国药典》2010年版所收录,中文版《中国植物志》[4]也承认该种的成立,然而随后《中国植物志》的同一作者却出版了截然不同的意见,陈心启等[3]在讨论长江中下游地区的贝母属分类时,认为湖北贝母的性状变异幅度在广义的天目贝母F.monantha性状变异范围内,进而在2000年出版的《Flora of China》中将湖北贝母作为天目贝母的异名处理.这一处理是建立在形态学基础上的,是否合理应该得到更多其他领域的数据支持,有待进一步深入研究探讨.

近十几年来,随着分子直接测序技术的普及,DNA序列片段已经被广泛运用于植物系统学的研究.ITS为核核糖体DNA内转录间隔区,具有较快的进化速率,适于用来解决一些较低分类阶元的问题,应用最为广泛.叶绿体基因为单拷贝基因,有利于系统树的构建.rpl16是cpDNA中进化速率最快的内含子之一,一般用于较低分类阶元或近缘类群间[5].matK是叶绿体基因组的蛋白编码区中进化最快的基因之一,也是近年中分子系统发育研究中使用频率最高叶绿体片段之一[6].在国外尤其是中东地区,有关贝母属分子系统的研究较为深入,但国内这方面的报道还很少见,本实验根据国外贝母属分子系统学研究基础[7]选择ITS,rpl16,matK 3个序列片段,对中国贝母属下的部分植物开展分子系统学研究,焦点集中于与天目贝母和湖北贝母亲缘关系较近的几个物种,以期利用分子证据解决分类系统难题,同时也为贝母类药材基源的准确分类和应用提供更多的证据.

1.材料与方法

1.1 样品采集 用于本实验中湖北贝母、天目贝母及亲缘关系较近的贝母属植物均采自模式产地的野外或栽培居群,为硅胶干燥的新鲜叶片,可以较好的代表该种贝母植物,来源见表1.植物标本由北京药用植物研究所张本刚研究员鉴定,凭证标本保存于北京协和医学院药用植物研究所资源中心.另外伊贝母以及作为外类群分析用的川百合序列来源于GenBank.

1.4 PCR扩增与测序 PCR扩增反应在ABI 2720PCR扩增仪上进行.PCR酶采用北京艾德莱生物科技有限公司的2×Taq PCR Master Mix.

PCR扩增反应体系25 μL：12.5 μL Master Mix,引物（ITS 2.5 μmolL-1；rpl16,matK 5 μmolL-1） 各1,2 μL总DNA样品,8.5 μL ddH2O.

PCR扩增程序为：94 ℃预变性（ITS 3 min；rpl16,matK 5 min）；94 ℃变性1 min,退火1 min（ITS 58 ℃；rpl16 54 ℃；matK 53 ℃ ）,72 ℃延伸（ITS,rpl16 2 min；matK 2.5 min）；循环数（ITS 32；rpl16,matK 35 ）；72 ℃延伸（ ITS 5 min；rpl16,matK 7 min）；4 ℃保存.

1.5 序列测定 PCR 产物的纯化和序列测定均由中美泰和生物技术（北京）有限公司完成. PCR 产物直接双向测序,测序引物为PCR引物.为保证测序顺利,部分样品的matK序列加测了中间引物.

1.6 序列分析 所测序列用CodonCode Aligner 3.7.1（Condon Code Co.,Germany）进行校对拼接,然后用MEGA5.2对其与从GenBank中下载的序列进行比对.以川百合为外类群,采用对最大简约法（maximum parsimony, MP）、最大似然法（maximum likelihood, ML）对3个序列进行联合构建系统树：最大简约树的构建采用PAUP4.0b10进行,使用启发式搜索,TBR分支交换算法；最大似然树的构建采用MEGA5.2进行,使用T-3-P + G的模型.最大似然使用的模型由MEGA5.2计算所得.用靴带分析（bootstrap）1 000次重复检验分支的可靠性,空缺（gap）始终做缺失（missing）处理.

2 结果与分析 2.1 测序结果 本实验分析用物种中,ITS序列排序后长度是611 bp,Gap作缺失处理时,变异位点18 bp,信息位点15 bp.rpl16序列排序后长度是907 bp,变异位点9 bp,信息位点6 bp.matK序列排序后长度是1 260 bp,变异位点11 bp,信息位点9 bp.

2.2 湖北贝母的系统位置 本实验以川百合为外类群,采用最大简约法和最大似然法将ITS,rpl16,matK 3个序列联合构建了系统树,得到1棵最简一致树和1棵最大似然树,见图1,2.从图中可知,2种方法构建的系统树的拓扑结构基本一致,仅支持率存在一些差异.系统树上,川贝母复合群聚成一支,长江中下游的贝母属植物聚成一支.湖北贝母、安徽贝母、天目贝母三者的居群首先各自聚成一支,之后天目贝母与安徽贝母聚成一支,最后与和湖北贝母形成一支.表明湖北贝母与天目贝母的亲缘关系可能要远于安徽贝母与天目贝母之间的关系,因此从本实验的分子证据来看,并不支持将湖北贝母归并于天目贝母的观点.

3.讨论

我国贝母属植物在地理分布主要有4个区域：西北新疆地区的新疆伊贝母群,西南的横断山脉及周围边地区的川贝母复合群,长江中下游贝母群,以及东北的平贝母,另外还有系统位置相对孤立的米贝母F. didii和轮叶贝母F. maximowiczii.对长江中下游贝母群的意见《中国植物志》（湖北贝母F.hupehensis,天目贝母F.monantha,浙贝母F.thunbergii；东阳贝母F.thunbergii var. chekiangensis）与《Flora of China》（安徽贝母F.anhuiensis（新增）,天目贝母F.monantha（包含湖北贝母）,浙贝母F.thunbergii,东阳贝母F. thunbergii var. chekiangensis）不一致.湖北贝母、天目贝母、安徽贝母3种都属于贝母组sect. Fritillaria,分布于长江中下游地区,亲缘关系较近.但三者之间形态和地理分布上也存在着一定差别,湖北贝母分布于湖北西南部、四川东部和湖南西北部,海拔相对较高,后两者主要分布于安徽、浙江等低海拔地区,天目贝母的最高海拔在1 300 m.从本研究的系统发育树上可以看出,天目贝母和安徽贝母先聚成一支,然后湖北贝母再与上述2种聚为一支,并进而与川贝母复合群分立开来.这种分枝拓扑结构,暗示着湖北贝母与天目贝母和安徽贝母具有较近的亲缘关系,三者构成一个自然类群而与川贝母群的系统关系较远.

湖北贝母、天目贝母和安徽贝母3个类群之间,尽管由于亲缘关系较近,可能存在着复杂的关系,然而现有的拓扑树显示天目贝母与安徽贝母首先聚为一支,再与湖北贝母聚合,这表明湖北贝母和天目贝母存在着较大的差别,在《Flora of China》中已经承认了安徽贝母的物种位置,按照此分支系统树的证据,那么《Flora of China》将天目贝母和湖北贝母归并为同一个物种的观点显然是值得商榷的.事实上,湖北贝母与天目贝母的形态性状差别也比较明显,湖北贝母的叶状苞片先端卷曲,花梗长1～2 cm,叶通常3～7枚轮生等性状特征不同于天目贝母,天目贝母的苞片不卷曲,叶多对生,花通常单朵[2].

陈心启等基于形态性状的观察与认识,对长江中下游的贝母属植物进行整理,归并了大量贝母新种,但有学者的研究也提出不同的意见[12],因此寻找更多的其他方面,特别是分子生物学证据无疑对解决贝母属的混乱分类是大有裨益的.

湖北贝母的鳞茎作为中药贝母使用具有较为久远的历史,谢志民[13]、尚志钧等[14]对贝母本草的考证均认为湖北贝母在唐代便入药当贝母使用,《唐本草》中记载“此叶似大蒜,四月蒜熟时采,良.若十月苗枯,根亦不佳也.出润州、荆州、襄州者最佳,江南诸州亦有,味甘苦不辛.”据考证“荆州、襄州者”有可能是湖北贝母.自20世纪70年代肖培根命名订种以后,湖北贝母在湖北地区被大面积的栽培,现在已成为主流的商品贝母之一,2000年及以后版本的《中国药典》均有收录.

多卷册的《Flora of China》出版极大的推动了中国植物分类学的进展,也为中药材的分类鉴定带来了极大便利,然而一些物种的处理与传统观点（特别是道地药材）出现了一些矛盾,湖北贝母即是其中一例,这也为传统道地药材的鉴定和应用带来了不便.《Flora of China》的绝大部分物种处理依然沿袭了传统的形态学观点处理物种,而形态学性状往往难以避免主观意见的参杂其中,因此需要更多的来自于其他领域的证据来进一步研究物种亲缘关系,特别是分子生物学领域的发展和证据已经广泛被科学共同体所接受,本文正是基于分子系统学的方法和手段,结合形态性状分析,探讨了湖北贝母的系统位置,对湖北贝母和天目贝母的亲缘关系提出了新的证据,为进一步明确药材湖北贝母正确使用提供科学基础.

[致谢]赵明水、丁燕、胡凤山、张振华、孙学德、熊佳平、肖俊国、洪家玉、王家政、由金文、刘海华等在采样中给予帮助,李西文老师在川贝母样品的采集中给予帮助,谢磊老师在数据分析过程中给予指导帮助.

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[14] 尚志钧, 刘晓龙. 贝母药用历史及品种考察[J]. 中华医史杂志, 1995, 25（1）： 38.

Phylogeic analysis for Fritillaria hupehensis： evidence from ITS,

rpl16 and matK sequences

LAI Hong-wu, QI Yao-dong, LIU Hai-tao, LIU Jiu-shi, ZHANG Ben-gang*

（ Key Laboratory of Bioactive Substance and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education,

Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences,

Peking Union Medical College, Beijing 100193, China）

[Abstrcat]The systematic position of Fritillaria hupehensis has been in dispute. Phylogentic analyses were conducted on sequences of ITS, rpl16, matK sequences for species of F. hupehensis and allies. Lilium didii was designed as outgroup. The analyses were performed using MP and ML methods. Conclusions could be achieved as follow. The topologies of MP and ML are consistent. The samples of F. hepehensis from different places form a supported clade with a strong bootstrap. And then form a strongly supported clade with F. anhuiensis, F. monantha. The results suggests that although F. hupehensis has a closet relation with the two ones, it exists some difference.

[Key words]Fritillaria hupehensis； Fritillaria monantha； Fritillaria anhuiensis； ITS； rpl16； matK

doi：10.4268/cjcmm20141711

[责任编辑 吕冬梅]