生防细菌LN04抑菌谱检测其抗菌蛋白部分特性

摘 要：LN04是一株分离自鳗鲡养殖场排污口附近的芽孢杆菌（Bacillussp.）,其发酵上清液与淡水养殖主要病原菌进行拮抗试验,结果表明,LN04对嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）、迟缓爱德华菌（Edwardsiellatarda）、星状诺卡氏菌（Nocardiaasteroides）和鳗弧菌（Vibrioanguillarum）有很强的抑制作用.LN04的无菌发酵液经硫酸铵沉淀,沉淀物透析除盐后所得的活性物质粗提物初步鉴定为一种抗菌蛋白质,该抗菌蛋白可耐受100℃的高温,对酸的耐受性也比较强,但对部分蛋白酶敏感.LN04对部分淡水养殖病原菌的强抑菌作用和它的抗菌蛋白对环境条件的高稳定性,表明该菌有可能作为一种生防细菌,开发应用于淡水养殖中细菌病害的防治.

关 键 词：生防细菌；抑菌谱；抗菌蛋白

中图分类号：S432.4文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.004

细菌病是水产养殖过程中的常见病害,慢性或急性发作都会造成养殖生产的重大损失[1].目前施用抗生素是细菌病防治的主要手段,但应用抗生素防治细菌病往往引发诸多严重问题,包括细菌耐药性、药残及对养殖环境和流域因抗生素本底残留而造成的污染等[2].国内外诸多研究和生产实践表明,针对性地筛选病原菌的拮抗菌,通过以菌治菌,可有效寻找到解决细菌性疾病的新途径[3-7].本研究从鳗鲡养殖场排污口附近分离到一些水产常见致病菌的拮抗菌,其中菌株LN04对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌、星状诺卡氏菌和鳗弧菌有很强的抑制作用,笔者开展了该菌株的抗菌谱检测试验并对其抗菌蛋白的部分特性进行了分析,以期为该生防菌株的开发应用提供科学依据.

1材料和方法

1.1样品来源

用于分离目标菌株的样品采自福建福清市某一鳗鲡养殖场,该养殖场经常发生严重的鳗鲡细菌性病害.

1.2拮抗菌的分离和富集

1.2.1培养基分离培养基：蛋白胨10g,酵母提取物5g,琼脂20g,NaCl10g,水1000mL.

富集培养基：蛋白胨20g,甘油10mL,K2HPO41.5g,MgSO4·7H2O1.5g,水1000mL.

1.2.2拮抗菌的分离、富集先以梯度稀释法对样品进行若干梯度的稀释,然后采用涂布平板法在装有分离培养基的平板上进行各梯度稀释液的涂布,置于生化培养箱中培养.24h后,挑取单菌落至装有上述富集培养基的试管,置于台式摇床中进行发酵（37℃,180r·mim-1）,32h后下摇床,通过离心或滤膜过滤的方法进行除菌,获得上清液,然后检测上清液是否有抑菌活性.

1.2.3抑菌活性检测抑菌活性的检测方法按照参考文献[8]进行,指示菌为鳗弧菌（Vibrioanguillarum）,该菌来自于国家海洋局第三海洋研究所微生物实验室.

1.2.4拮抗菌的初步鉴定应用菌株的形态学、生理生化试验以及菌株的16SrDNA测序比对,进行拮抗菌的初步鉴定,其中16SrDNA测序委托上海生工生物工程技术怎么写作有限公司完成.

1.3菌种发酵和抑菌谱检测

1.3.1菌种发酵把筛选到的拮抗菌接种至装有KB液体培养基的三角瓶中（接种量5%）进行发酵培养（37℃,200r·min-1）,发酵持续48h,然后发酵液离心（8000r·mim-1,10min,4℃）去菌体,所得上清液于4℃保存备用.

1.3.2抑菌谱测定选择鳗鲡养殖主要常见致病菌,包括嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）、迟缓爱德华菌（Edwardsiellatarda）、星状诺卡氏菌（Nocardiaasteroides）、鳗弧菌（Vibrioanguillarum）、荧光检测单胞菌（Pseudomonaluorescens）、温和气单胞菌（Aeromonassobria）等作为抗菌谱检测菌（这些检测菌除鳗弧菌外均来自于福建师范大学教育部工业微生物重点实验室）,按1.2.3方法,进行目标菌发酵上清液对这些病原菌的抑菌作用检测,得出所选目标菌（拮抗菌）的抑菌谱.

1.4抗菌物质类型的初步鉴定

根据预试验结果,把发酵液除菌后所得上清液用饱和度为70%的硫酸铵溶液沉淀,离心（10000r·mim-1,10min,4℃）后得沉淀物和离心液,对沉淀物进行透析除盐,并进行浓缩,得到抗菌物质（即抗菌蛋白）粗提物,用无菌水复溶粗提物,以KB培养基为对照,用1.2.3的方法分别检测该粗提物、离心液及上清液的抑菌活性并进行比较.

1.5抗菌蛋白部分特性分析

抗菌蛋白的特性分析参考文献[9]的试验方案进行,主要考察抗菌蛋白粗提物在不同温度、酸碱度及蛋白酶作用下,其抑菌活性所受影响和变化.

1.5.1不同温度对抗菌蛋白抑菌活性的影响抗菌蛋白粗提物分别在50,70,90,100℃下处理30min,另外以巴斯德蒸汽加压消毒方式（121℃）处理20min,待温度恢复至常温后,对处理过的抗菌蛋白粗提物进行抑菌活性检测,并与处理前（作为对照组）进行对比.

1.5.2不同pH值对抗菌蛋白抑菌活性的影响依次用pH值为2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0的酸碱梯度在恒温37℃下处理抗菌物质30min,而后再用弱酸弱碱把处理液调回原值,而后进行抑菌活性检测,并与处理前（作为对照组）进行对比.

1.5.3不同蛋白酶对抗菌蛋白抑菌活性的影响选择4种常见蛋白酶包括胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶以及胰蛋白酶分别与抗菌蛋白粗提物进行酶解反应,反应条件设定为：酶浓度1mg·mL-1,反应温度37℃,反应时间60min.酶解反应完成之后,水浴加热（100℃,15min）使酶失活,然后进行抑菌活性检测,并与处理前（作为对照组）进行对比.2结果与分析

2.1筛选结果及目标菌的初步鉴定

从样品筛选到对鳗弧菌有抑菌作用的候选菌11株,编号LN01～LN11,其中LN04抑菌作用最强.形态学的观察显示,LN04的菌落呈乳白色,表面有褶皱、细胞呈杆状,菌内有椭圆形芽孢.菌株的生理生化试验结果为：G+,好养性生长,而葡萄糖发酵、柠檬酸盐发酵、淀粉水解、明胶液化、V-P测定等反应皆呈阳性,据此并参照伯杰[10]和东秀珠[11]的相关细菌鉴定方法,以及比对所测得的16srDNA序列,初步鉴定所筛选、获得的LN04为芽孢杆菌属（Bacillussp.）.

2.2LN04的抑菌谱

在实验室条件下,基于抑菌谱测定的LN04拮抗试验结果如表1所示.

拮抗试验结果表明,LN04对嗜水气单胞菌、迟缓爱德华菌、星状诺卡氏菌和鳗弧菌均有很强的抑制作用,其中对嗜水气单胞菌的抑菌效果最好.

2.3抗菌物质类型的初步鉴定结果

利用离心、盐析、透析对LN04发酵液进行处理,得到了粗提物,以KB培养基为对照,按1.2.3的方法,在同一个抑菌板上进行离心液、发酵上清液、粗提物和对照组（从左到右依次排列）抑菌活性检测试验,结果如图1.显然,活性物质为胞外分泌物,并且大部分集中在粗提物中,因为粗提物的抑菌圈明显大于上清液的抑菌圈.由于硫酸铵对蛋白质具有选择性沉淀性质,因此,LN04发酵过程中产生的胞外抑菌活性物质可初步鉴定属于蛋白类.

2.4温度对抗菌蛋白粗提物抑菌活性的影响

抗菌蛋白粗提物经各温度梯度处理一定时间后,按1.2.3的方法进行抑菌活性检测,结果见如下表2.试验结果表明,LN04的抗菌蛋白对热稳定,当温度超过100℃时,其抑菌活性仅降低15%.

2.5pH值对抗菌蛋白粗提物抑菌活性的影响

按设定的温度梯度和时间对抗菌蛋白粗提物进行处理,然后按1.2.3的方法进行抑菌活性检测,结果如表3所示.LN04的抗菌蛋白粗提物对酸碱度的适应范围较宽,在pH值范围为4～10时,抑菌活性影响不是很大,但强酸和强碱对抑菌活性的破坏相当明显.

2.6蛋白酶对抗菌蛋白粗提物抑菌活性的影响

所选择的4种蛋白酶分别与抗菌蛋白粗提物酶解反应后,马上进行失活,然后按1.2.3的方法进行抑菌活性检测,结果见表4.可以发现,LN04的抗菌蛋白对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感,但对蛋白酶K和木瓜蛋白酶则具有较好的稳定性.

3讨论

鳗鲡养殖通常采用集约化模式,如室外水泥池高密度养殖、室内玻璃纤维桶超高密度循环水养殖等.由于拥挤效应和管理疏漏等原因,各种病害经常发生,特别是细菌性病害如出血病、阑尾病、脱粘症、肠炎等[12].基于水产品安全考虑,抗生素用于水产养殖细菌性病害防治已受到越来越多的限制,人们开始探索生防细菌用于细菌病防治的可行性并取得良好的效果.芽孢杆菌是一类重要的生防细菌,其筛选及开发利用受到国内外的极大重视,并已在生产上得到成功的应用[13-14].在本研究中,LN04筛选自鳗鲡养殖场的排污口,由于排污口特殊的生境,在长期的作用下,LN04具有了拮抗所在环境中某些病原菌的特殊功能,表现为LN04在实验室条件下对嗜水气单胞菌具有强抑制作用,对迟缓爱德华菌、星状诺卡氏菌和鳗弧菌也有很强的拮抗性能.

生防细菌的拮抗性能,有来自活菌本身的,也有来自其分泌的拮抗物质如（抗菌蛋白）,或两者兼之.所分泌的活性物质,有的分泌于胞内,有的分泌于胞外.作为抗菌物质,其应用价值除了与其活性和抑菌范围（抑菌谱）有关外,还与抗菌物质的稳定性有重要关系[15-16].本研究结果显示,LN04所分泌的胞外抗菌蛋白对环境条件的稳定性良好,其中对高温表现出很好的稳定性,对酸碱度的适应范围也较广,对蛋白酶K和木瓜蛋白酶也不是很敏感,LN04的这些良好性能,包括较好的抑菌活性、较广的抑菌谱、以及抗菌蛋白对环境条件较好的稳定性,预示着该生防菌株有较好的开发与应用前景.