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XXXXXXX的研究

xxx,xxx2*,x x3

( 1. XXX大学学院,哈尔滨 150010,2.农业大学XXX学院,哈尔滨 150030,

3. XXXXXXXX学院,黑龙江 大庆 161090 )

摘 要:利用长期施用长残留除草剂咪唑乙烟酸的土壤,采用高压富集的方法,从两种培养液分离出3株细菌,根据菌株的形态特性和生理生化特征,对此3个菌株进行了初步鉴定:菌株X为丙酸杆菌属(Propionibacterium),菌株Y为海球菌属(Marinococcus),菌株Z为酸单胞杆菌属(Acidomonas),菌株X,Y和Z的最适生长温度分别是30,30和35 ℃,菌株X和Z在中性偏酸的培养基中生长较好,菌株Y在偏碱培养基中生长较好,菌株X,Y,Z生长最适合的葡萄糖含量分别为0.5%,1%和0.1%,菌株Y生长最适咪唑乙烟酸的浓度是10 mg a.i.·L-1,菌株X和Z生长最适咪唑乙烟酸的浓度是20 mg a.i.·L-1.

关 键 词 :咪唑乙烟酸,降解菌,富集分离,鉴定,生长特性

中图分类号:S767.5,X172 文献标志码:A

Separation identification and growth characters of herbicide imazethapyr degrading-bacteria

XXX Xxxx1, 2, 3

(1. College of , Xxx, Harbin 150010, China,

2. College of Xe, Xxxxx, Harbin 150030, China,

3. Xxxx of Xxxxxxx, Daoqin Heilongjiang 161090, China)

Abstract: Using the high pressure enrichment method, three bacteria strains in two culture media were separated from soil, which contained the herbicide imazethapyr and were long polluted by the pesticide. By batch culture with clomazone as a sole carbon, strain X was identified as Propionibacterium, strain Y was identified as Marinococcu, and strain Z was identified as Acidomonas according to the morphological and physiological char-acters. The optimal temperature for growth of X, Y and Z were 30, 30, and 35℃, respectively. The growth of strain X and Z was good in neutral and weak acidic culture media, but strain Y was appropriate to growth under alkalescence, the optimal sugar contents for growth of X, Y and Z were 0.5%, 1% and 0.1%, respectively. The optimal initial concentration for imazethapyr of Y was 10 mg a.i.·L-1, and that for X and Z was 20 mg a.i.·L-1.

Key words: imazethapyr, degrading microanis, enrichment separation, identification, growth characters咪唑乙烟酸(Imazethapyr)是由美国氰胺公司(现归并为德国BA公司)于80年代初开发研制的大豆田选择性苗前,苗后早期除草剂,主要防除稗草,反枝苋等一年生禾本科杂草和阔叶杂草.咪唑乙烟酸具有杀草谱广,选择性强,活性高等优点,它可以被植物的叶片和根系吸收,在木质部与韧皮部内传导,积累于分生组织[1-2].其作用方式是抑制乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase,ALS),破坏蛋白质合成,使植物生长受抑制而死亡.而豆科植物吸收咪唑乙烟酸后,在体内很快被分解,因此是大豆田优良的除草剂[3-4].其在黑龙江省应用尤其广泛,2005年总用量为3 905 t,应用面积达到5.25×104万hm2,占大豆田除草剂面积的70%,至今因品种竞争和残留限制问题其用量有所下降,但仍然是大豆田的主导品种[5-6].残留在土壤中的低量咪唑乙烟酸残易对水稻,马铃薯,甜菜,油菜,番茄,甘蓝等敏感的后茬作物产生药害[7],严重影响了黑龙江省种植业结构的调整和换茬轮作,已成为亟待解决的农业生产问题.

咪唑乙烟酸在土壤中降解主要受微生物影响,目前,有关咪唑乙烟酸方面的降解微生物筛选及生物降解的研究还未见报道.本研究立足大豆田咪唑乙烟酸的使用情况,针对咪唑乙烟酸残留的问题,筛选出能够高效降解咪唑乙烟酸的微生物,对其进行鉴定,驯化和培养,并进一步研究其降解效果以及生物降解菌剂等,旨在解决咪唑乙烟酸的残留药害问题,力争延长这一大豆田优良除草剂品种的使用寿命,同时为该除草剂环境污染的治理开辟一条有效的途径,为农业的可持续发展提供有效的技术保障.

1 材料与方法

1.1 菌种

1.1.1 供试药剂

95.7%咪唑乙烟酸原药,哈尔滨利民农化有限公司提供,5%普施特水剂,购自德国巴斯夫公司.

1.1.2 供试土壤

采自东北农业大学香坊农场长期施用过长残效除草剂咪唑乙烟酸的土壤.

1.1.3 供试培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基:用于细菌培养,主要成分有牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,琼脂18 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0～7.2,富集培养液:用于微生物筛选,主要成分有牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,NaCl 5 g,K2HPO4 5 g,蒸馏水1 000 mL,pH 7.0～7.2,平板计数琼脂培养基:用于细菌计数,主要成分为蛋白胨5 g,酵母膏2.5 g,葡萄糖10 g,琼脂13 g,蒸馏水1 000 mL,pH 6.9～7.1.

1.2 方法

1.2.1 咪唑乙烟酸降解细菌的富集分离

在250 mL的三角瓶中,加入100 mL富集培养基(含咪唑乙烟酸浓度为100 mg a.i.·L-1),将采集的土样10 g接入到培养液中,设置3次重复,置于30 ℃,转速为150 r·min-1的摇床上振荡培养,7 d后按10%的接种量取培养液将其移入含咪唑乙烟酸浓度为200 mg a.i.·L-1新鲜培养基中,继续培养7 d,以后每隔1周均从上次的培养液中取出10 mL加入到100 mL新鲜培养基中,咪唑乙烟酸的浓度每次增加100 mg a.i.·L-1,直至增加到600 mg a.i.·L-1,共富集培养6次,然后转入到基础盐培养基中进行筛选,共进行3次,培养基中咪唑乙烟酸的浓度分别为800,1 000和1 200 mg a.i.·L-1.然后取样,在牛肉膏蛋白胨培养基上按细菌菌落形态,颜色进行单个菌落分离,挑出单细菌菌株分别进行纯化培养并保存.最后选择在含咪唑乙烟酸的牛肉膏蛋白胨培养基平板中可以大量生长的菌株作为目标菌株进行研究.

1.2.2 降解细菌的鉴定

1.2.2.1 形态鉴定

将各株细菌进行简单染色,革兰氏染色,荚膜染色,芽孢染色和鞭毛染色,在显微镜下进行镜检,作形态观察和描述.

1.2.2.2 生理生化鉴定

通过接触酶,葡萄糖氧化发酵,红,淀粉水解,硝酸盐还原,乙醇氧化,明胶液化,反硝化,柠檬酸盐等来进行鉴定试验,鉴定至属[8-10].

1.2.3 降解细菌生长特性的研究

通过在不同异 草酮初始浓度,不同温度,不同pH及不同外加碳源量的条件下,对这3种降解菌进行生长量的研究,以确定降解菌的最适生长条件.以波长为650 nm处的OD值表示菌体生长量.

2 结果与分析

2.1 降解咪唑乙烟酸细菌的富集分离与鉴定

2.1.1 咪唑乙烟酸降解菌的分离

按照上述富集筛选降解菌株方法,经过40 d的富集培养液培养,并转入基础盐培养基继续筛选培养20 d,取最后筛选培养液,经10倍稀释法,将10-4,10-5,10-6的培养液稀释液分别转至牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线培养,待出现单个菌落后,按照菌落的形状,直径,颜色,透明度,边缘,粘度不同,发现有5株不同的细菌菌株生长,挑取菌株,编号记为X,Y,Z,W,M,继续在牛肉膏蛋白胨含药培养基平板上培养上述5株细菌,发现菌株X,Y,Z在含药培养基可以大量生长,因此决定对这3株细菌进行研究.

2.1.2 降解细菌的形态特征

将所筛选到3株细菌接种到培养皿中,置于30 ℃恒温培养箱中培养24 h后,观察细菌形状,大小,运动性和菌落特征,结果如表1所示.

表 1 降解细菌的形态特性和菌落特性

Table 1 Form and lawn characters of degrading bacteria

项目

Item菌株 StrainsXYZ形状Shape杆状球状杆状长或直径μm) Diameter3.03803.24083.0021宽μm) Width1.0943无1.2443运动性Motility运动运动不运动菌落特征Characters of bacteria colony表面光滑,边缘光滑,隆起生长,不透明,在培养基上呈红色.表面光滑,边缘有褶皱,隆起生长,不透明,在培养基上呈乳.表面光滑,边缘有褶皱,隆起生长,透明,在培养基上呈白色.试验Test菌株StrainsXYZ革兰氏染色 Gram stain+--芽孢 Spore stain (1)无无无需氧性 Characters of needing oxygen+++接触酶 Contact enzyme+-+淀粉水解 Starch hydrolysis ( 2)+-+红(MR) Methyl red++-乙酰醇(VP) Acetyl methyl carbinol (3)+--明胶液化 Liquefy glutin+-+柠檬酸盐利用 Use of citrate+++葡萄糖分解代谢形式 Modality of deposing and metabolizing of glucose发酵氧化氧化荧光色素 Fluorochrome-+-硝酸盐还原 itrate reductase+++反硝化enitrification (Fig. 4)+++乙醇氧化 lcohol oxidation-+-注:"+"表示生化反应(或革兰氏染色)为阳性,"-" 表示生化反应(或革兰氏染色)为阴性.

Note: "+"means positive biochemical reaction(or gram stain), "-"means negative biochemical reaction(or gram stain).

XYZ图1 菌株X,Y和Z的芽胞染色

Fig. 1 Spore stain of X, Y and Z bacteria

图2 菌株X,Y和Z的淀粉水解试验

根据降解细菌培养特征及生理生化特征的测定结果,对3株降解细菌进行初步鉴定,结果为:X为丙酸杆菌属(Propionibacterium),Y菌为海球菌属(Marinococcus),Z菌为酸单胞杆菌属(Acidomonas).

2.2 降解细菌生长特性的研究

2.2.1 咪唑乙烟酸浓度对降解细菌生长的影响

牛肉膏蛋白胨培养液中,咪唑乙烟酸浓度为5,10,20,50和100 mg a.i.·L-1时,24 h后,测定各菌悬液的OD650值,各菌株的生长趋势见图5.

图5 咪唑乙烟酸浓度对各菌株生长的影响

Fig. 5 Effect of imazethapyr concentration on the growth of bacteria

由图5可以看出,培养液中的咪唑乙烟酸浓度对3株细菌X,Y和Z的生长均有一定的影响,低浓度在5～10 mg a.i.·L-1范围内,各株细菌的生长量OD650值显着增加,当浓度超过10 mg a.i.·L-1,菌株Y的生长随着药剂浓度的增大而受到抑制,其OD650值逐渐减少,超过20 mg a.i.·L-1,X,Y和Z的生长趋势均显着下降.生长量最多的所在浓度可认定为是细菌生长的最适浓度,说明Y的生长适宜浓度为10 mg a.i.·L-1,X和Z的生长适宜浓度为20 mg a.i.·L-1.各菌株耐药能力由强到弱的顺序为Z>,X>,Y.

2.2.2 温度对降解细菌生长的影响

当牛肉膏蛋白胨培养液,接种各菌株后,在培养温度为15,25,30,35,40 ℃条件下,24 h后,测定各菌悬液的OD650值,各菌株的生长趋势如图6所示.

结果表明,培养温度对各株细菌的生长也有一定的影响.在15～30 ℃范围内,温度升高,各菌株的生长量也随之提高,当上升到一定温度时,生长量变化趋势出现差异,菌株X和Y在30 ℃时生长量OD650值达到最大,而Z在35 ℃时达最大,且在40 ℃时,生长量虽有所下降,但其生长量仍然很高,说明菌株Z对温度的适应范围相对较宽.

3讨 论

讨论一定要扣准文题和结果.具体地说可参考下面5个方面进行:

对结果揭示的情况作进一步的说明和解释,特别是本研究结果所具有的理论和实际意义,

②结合结果深入探讨与本研究相关的新方法,新理论以及预测发展趋势,

③比较本研究与他人研究的异同,并实事求是地指出各自的优点和不足,

④总结本研究的成败关键,经验和教训,客观地反映本研究的不足,包括研究中矛盾现象及尚难解决的问题,

⑤对进一步的研究提出建议或指出方向.

可以加二级标题.如3.1,3.2,3.3等.

4 结 论

在这一部分里,作者应该真实,准确,客观地描述实验观察到的结果,并提供所测定的具体数据.对于实验所观察到的结果,一定要实事求是地叙述,无论正面或反面,阴性或阳性的结果,均应客观报道,而不能根据自己的主观意愿随意取舍.但也要避免将所有数据和盘托出,简单罗列的做法,对于实验数据的叙述要分清主次,并应对实验数据进行统计学处理与分析,以找出规律性的信息.也可以以列出序号方式阐述.如a. b. c.等.

或者将讨论与结论整合论述.

[ 参 考 文 献 ]

参考文献类型[M],[C],[G],报纸[N],期刊[J],学位论文[D],报告[R],标准[S],专利[P][DB],电子公告[EB],联机网络[OL].Oatley J M, de Avila D M, McLean D J, et al. Transplantation of bovine germinal cells into mouse testes[J].J Anim Sci, 2002, 80: 1925-1931.

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《东北农业大学学报》指南

1 来稿要求  1.1 要求:必须符合本刊宗旨,学术性强,理论水平高,反映国内,国际高水平的科学技术研究成果,论点明确,数据可靠,文字精炼,具有创新性,时代性,规范性. 1.2 文稿顺序:题目,作者姓名,单位,摘 要 ,关 键 词 ,中图分类号,正文,参考文献,英文摘 要 ,作者简介.请在文稿首页底脚处写明论文属何项目,基金资助来源,项目编号(加括号). 1.2.1 题目:一般不超过20个字. 1.2.2 作者:①作者姓名的汉语拼音姓前名后,姓氏字母均大写,名首字母大写,姓名均不可缩写,②多位作者的署名之间用逗号","分隔.不同工作单位的作者应在姓名右上角加注阿拉伯数字序号. 1.2.3 工作单位:应写明作者的工作单位及所在省市名,邮编.单位名称与省市之间应以逗号","分隔,英译文单位在邮编后加China. 1.2.4 摘 要 ,关 键 词 ,中图分类号:中文摘 要 200字左右,应有独立性和自含性,采用第三人称定法,不用"本文","作者"等主语.不应出现图表,数学公式和非公知公用的符号,缩略语,研究报告一般用报道性摘 要 ,其内容为目的,方法,结果和结论.综述性,评论性文章可用批示性摘 要 .英文摘 要 内容与中文内容一致.关 键 词 :(3～8个字),中图分类号:按中国图书分类法给出本篇文章的中图分类号.2 正 文  2.1 标题:正文内标题层次尽量减少,各层次一律用阿拉伯数字编号,不同层次的数字之间用圆点相隔,如1,1.1,2.1,2.1.1等,所有的标题号均左顶格后空一字写标题. 2.2 图表:文中图表应有自明性,只附最必要的,且随文出现,表的内容切忌与图及文字重复,图题,表题及表项应附英文. 2.2.1 图:图以6幅为限.坐标图用方框图,图标线纵坐标在左,竖线框内,横坐标在下栏线框内.图的主线与辅助线粗细比例为2:1,纵横坐标的标值,标值线必须写清,标目应使用标准的物理量和单位符号(一般不用中文表示).照片要黑白清晰,层次分明,反差适中,文稿中要留插图的位置(注:不用彩照). 2.2.2 表:表用三线表,每文不超过5个.表格应设计正确,简洁,合理,表项应尽量简化.表中数字须上下对齐,相邻栏内数字相同时不能用"``"或"同上","同左,右"等,应一一标注.如实测为零,就标注"0",未测或无此项(该栏为空白)或未发现,就标注"一"实测为痕量或可略而不计,应注明.表内不设"备注"栏,需要说明的事项,可用简炼文字附注于表格底线下方,且附英文.表中注释,可用"*"号. 2.3 量和单位:请使用法定计量单位,量名称及符号,单位,数字的用法等应符合国家标准,书写要规范化,并注明外文字母的大小写,正斜体及上下角标.3 参考文献  3.1 标准:本刊采用顺序编码格式着录.文献序号按正文出现先后顺序编排,并与文后参考文献对应,未公开发表的资料请勿引用. 3.2 主要责任者:三名以内的全部列出,超过三名时,后面加"等"字样.姓名之间用逗号","分隔. 3.3 参考文献类型及标识: 专着[M],论文集[C],报纸文章[N],期刊文章[J],学位论文[D],报告[R],标准[S],专利[P]. 3.3.1 专着,论文集,学位论文,报告 [序号]主要责任者.文献题名[文献类型标识].出版地:出版者,出版年,起止页码.. 3.3.2 期刊文章 [序号]主要责任者.文献题名[J]刊名,年,卷(期):起止页码.. 3.3.3 报纸文章,国际,国家标准,专利  ①[序号]主要责任者.文献题名[N]报纸名,出版日期(版次). ②[序号]标准编号,标准名称[S]. ③[序号]专利所有者.专利题名[P].专利国别,专利号,出版日期.4 作者简介  文章需附第一作者简介,书写标准:  姓名(出生年—),性别,民族(汉族可省略),籍贯,职称,学历,学位,主要简历,研究方向. 5 注意事项  稿件一式二份,作者自留底稿,投稿时需附电子文稿,先交纳100元审稿费后方可送审.不得一稿多投.作者如欲改投他刊,请与本刊联系.来稿用否,自投稿之日起一个月内予以通知.来稿文责自负,本刊对来稿可作文字修改,删节,对内容的修改可征得作者同意.由于人力有限,如无特殊情况,来稿无论用否一律不退.文稿被录用,即付稿酬和两册学报.

题目:一般不超过20个字

中文摘 要 200字左右,应有独立性和自含性,采用第三人称定法,不用"本文","作者"等主语.不应出现图表,数学公式和非公知公用的符号,缩略语,研究报告一般用报道性摘 要 ,其内容为目的,方法,结果和结论.

关 键 词 :(～8个字)

中图分类号:按中国图书分类法给出本篇文章的中图分类号.

英文摘 要 内容与中文内容一致.

单位与数字之间空一格.

量和单位:请使用法定计量单位,量名称及符号,单位,数字的用法等应符合国家标准,书写要规范化,并注明外文字母的大小写,正斜体及上下角标

表用三线表,每文不超过5个.表格应设计正确,简洁,合理,表项应尽量简化.表中数字须上下对齐,相邻栏内数字相同时不能用"``"或"同上","同左,右"等,应一一标注.如实测为零,就标注"0",未测或无此项(该栏为空白)或未发现,就标注"一"实测为痕量或可略而不计,应注明.表内不设"备注"栏,需要说明的事项,可用简炼文字附注于表格底线下方,且附英文.表中注释,可用"*"号.

图:图以6幅为限.坐标图用方框图,图标线纵坐标在左,竖线框内,横坐标在下栏线框内.图的主线与辅助线粗细比例为2:1,纵横坐标的标值,标值线必须写清,标目应使用标准的物理量和单位符号(一般不用中文表示).照片要黑白清晰,层次分明,反差适中,文稿中要留插图的位置(注:不用彩照).