奥沙利铂对口腔鳞状细胞癌的时辰治疗

[摘 要 ] 目的 比较奥沙利铂（L-OHP）在昼夜4个不同时间治疗口腔鳞状细胞癌的疗效和不良反应的差异,并分析其昼夜生物节律特征.方法 将75只裸鼠置于12 h光照/12 h黑暗交替的环境中,将人颊鳞状细胞癌BcaCD885细胞注入裸鼠颊部建立口腔颊鳞状细胞癌模型,3周成瘤后随机分为5组（4个实验组,1个对照组）,每组15只.4个实验组分别在24 h内的4个不同时间点,即灯亮后4、10、16、22 h（4 HALO、10 HALO、16 HALO、22 HALO）分别静脉注射L-OHP（17 mg·kg-1）,对照组静脉注射相同体积的生理盐水.给药后观察比较各组的疗效（抑瘤率和生存时间）、

不良反应（体重、白细胞计数和肛周肿胀）情况,并用余弦分析法检验疗效和不良反应是否具有昼夜节律性.结果 在4、16和22 HALO时间注射L-OHP均获得较好的抑瘤率,但只有在16和22 HALO两个时间给药显著延长了荷瘤鼠的生存时间；在16和22 HALO时间给药,荷瘤鼠的不良反应显著小于4和10 HALO给药；余弦分析表明不同给药时间对小鼠的生存时间、体重和白细胞计数的改变具有明显的昼夜节律变化特征,其中14.88 HALO注射L-OHP荷瘤鼠的生存时间最长.结论 用L-OHP对口腔鳞状细胞癌患者化疗应考虑时间因素,以增效减毒、提高患者生存率和生存质量.

[关 键 词 ] 时辰治疗； 鳞状细胞； 口腔癌； 疗效； 不良反应； 昼夜节律

[中图分类号] R 739.8 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.02.005

口腔癌约占全身恶性肿瘤的2%,其中90%为鳞状细胞癌.尽管手术、化疗和放疗取得了一些进步,但口腔癌患者的5年总生存率仍然只有50%～60%[1-2],因此,探索口腔癌新型有效的治疗方法具有重大意义.

人体的许多生理活动,如细胞新陈代谢和增殖等,在体内“生物钟”的调控下具有明显的昼夜生

物节律性,生物钟的调控中枢位于人体下丘脑基底部的视交叉上核（suprachiaatic nucleus,SCN）,它通过神经介质和激素使人体的生理活动随24 h明暗交替呈规律性变化[3-4].目前研究发现：人体正常细胞和肿瘤细胞的生长、增殖以及影响药物分解代谢酶的活性有明显的时间节律,使一些抗癌药物随给药时间的不同抗癌活性和不良反应产生显著差异[5].时辰化疗就是根据机体自身生物节律,选择合适用药时间,以达到最大疗效和最小不良反应,提高患者的生存率和生存质量[5-6].

铂类抗癌药物是目前治疗口腔鳞状细胞癌最常用和最有效的药物之一,目前研究显示：铂类药物的抗癌活性和不良反应具有昼夜时辰特征[4-5].为了深入了解铂类药物对口腔鳞状细胞癌的时辰作用和规律,本研究将人口腔颊鳞状细胞癌BcaCD885细胞注入裸鼠颊部,建立裸鼠BcaCD885颊鳞状细胞癌模型,用第3代新型铂类抗癌药物奥沙利铂（Oxaliplatin,L-OHP）在昼夜4个不同时间给药,观察和比较不同时间给药后药物的抑瘤率、小鼠生存时间和不良反应,并行余弦分析检验不同时间给药的疗效和不良反应是否有昼夜节律性以及昼夜节律性规律,为临床更加安全、有效地用药提供依据.

1.材料和方法

1.1 试剂和仪器

人颊鳞状细胞癌细胞株BcaCD885（四川大学口

腔疾病研究国家重点实验室）,L-OHP、RPMI 1640培养基（Sigma公司,美国）,胎牛血清（Gibco公司,美国）,冷冻低速离心机（Z233MK-2,HERMLE公

司,德国）,光学显微镜（CYMML-EPXFU-068,Ni-kon公司,日本）.

1.2 实验动物

选取重庆医科大学实验动物中心提供的无特定病原体（SPF）级别BALB/c nu/nu品系裸鼠75只为研究对象,雌性,5～6周龄,体重19～20 g.

1.3 方法

1.3.1 裸鼠BcaCD885颊鳞状细胞癌模型的建立 将75只裸鼠置于标准化12 h光照/12 h黑暗环境中分笼饲养,每笼5只,垫料、饲料和饮水均经灭菌处理,室温为（24±1） ℃,空气湿度为60%±10%.时间以开灯后时间（hours after lights on,HALO）为参考,0 HALO为开灯时间,12 HALO为关灯时间,即12 HALO前为休息相,12 HALO后为活动相.实验前,裸鼠在此环境中适应3周.所有实验操作程序均经过重庆医科大学实验动物研究所实验动物使用管理委员会批准.

将BcaCD885细胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,然后放入37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养.取对数生长期的BcaCD885细胞,经0.25%胰酶消化,冷冻低速离心（4 ℃,1 000 r·min-1,离心

半径3 cm）5 min后,用无菌PBS配制成单细胞悬液.将0.2 mL含有2×106个BcaCD885细胞的悬液植入裸鼠颊部,继续在标准化12 h光照/12 h黑暗环境中分笼饲养.每天观察肿瘤生长情况,3周明显成瘤后进行实验.

1.3.2 给药方法和时间 按照随机数字表法,将75只荷瘤裸鼠随机分为5组,每组15只,即4个实验组和1个对照组.将L-OHP粉末用0.9%生理盐水配制成浓度为3.4 g·L-1溶液.4个实验组分别在24 h内的4个不同时间点,即灯亮后4、10、16、22 h（4 HALO、10 HALO、16 HALO、22 HALO）分别尾静脉注射L-OHP（17 mg·kg-1）,而对照组在以上4个不同时间点

尾静脉注射相同体积的0.9%生理盐水.

1.3.3 疗效评价 疗效评价指标如下.1）抑瘤率：在给药后第7天的22 HALO时,用游标卡尺对5组裸鼠肿瘤的最大径（a）和最小径（b）进行测量,肿瘤体积（V）等于0.5ab2,抑瘤率等于（对照组肿瘤平均体积-给药组肿瘤平均体积）/对照组肿瘤平均体积×100%.2）生存时间：给药后每只荷瘤鼠存活的天数. 1.3.4 不良反应 用外周血白细胞（white blood cell,

WBC）计数、荷瘤鼠体重和肛周肿胀率评估不良反应.即在给药后第7天,用电子天平称重裸鼠体重,观察裸鼠肛周肿胀情况；用清洁干燥的微量血红蛋白吸管刺入裸鼠尾静脉吸取静脉血20 μL,用人工血细胞计数方法检测外周血WBC数量.

1.4 统计学分析

采用Sigmaplot 12.0软件对数据进行分析,多均数比较用方差分析,率的比较用2检验；应用CircWe V 1.4软件行余弦分析,检验各指标是否具有昼夜节律性；绘制Kaplan-Meier生存曲线,用log-rank方法检验组间生存时间的差异性.P<0.05为差异有统计学意义.

2.结果

2.1 各组荷瘤鼠抑瘤率的比较

昼夜4个不同时间注射L-OHP 7 d后各组抑瘤率的测量结果见表1.不同时间给药其抑瘤率差异有统计学意义（2等于96.54,P<0.001）.在10 HALO给药抑瘤率最小,显著低于其他3个时间给药的抑瘤率；在4、16和22 HALO时间注射L-OHP均获得较好的抑瘤率,但三者抑瘤率差异无统计学意义（P>0.05）.

2.2 各组荷瘤鼠生存时间的比较

5组荷瘤鼠的平均生存时间见表1.5组荷瘤鼠的

平均生存时间的总体差异有统计学意义（F等于11.264,

P<0.001）.其中,4 HALO组和10 HALO组与对照组之间差异无统计学意义（P>0.05）,即表明在4 HALO和10 HALO时间点用药未显著延长荷瘤鼠生存时间.16 HALO组和22 HALO组与对照组之间差异有统计学意义（P<0.05）,证明在16 HALO和22 HALO时间点用

药显著延长了荷瘤鼠的生存时间,但是16 HALO和22 HALO组间小鼠生存时间差异无统计学意义（P>0.05）.以上证明在活动相注射L-OHP能显著延长荷瘤鼠的生存时间.

余弦分析表明：不同时间注射L-OHP后荷瘤鼠的平均生存时间有昼夜节律性（F等于7.95,P等于0.000 9）.

根据余弦拟合曲线显示：2.86 HALO时注射L-OHP荷瘤鼠生存时间最短,为12.02 d；14.88 HALO时注射L-OHP荷瘤鼠生存时间最长,为20.75 d（图1）.

Kaplan-Meier生存曲线分析：10 HALO组裸鼠生存时间最短,16 HALO组裸鼠生存时间最长（log-rank 2等于13.84,P<0.01）,具体见图2.

2.3 各组荷瘤鼠不良反应的比较

2.3.1 WBC计数 在昼夜4个不同时间点注射L-OHP后荷瘤鼠的WBC均发生显著性减少,其中,10 HALO组WBC减少最多,16 HALO组WBC减少最少.5组荷瘤鼠WBC的差异有统计学意义（F等于274.42,P<0.001）,

并且不同组之间两两比较荷瘤鼠WBC的差异均具有统计学意义（P<0.001）（表1）.余弦分析表明：不同

时间注射L-OHP后荷瘤鼠的WBC减少具有昼夜节律性（F等于62.13,P<0.001）.根据余弦拟合曲线显示：

18.80 HALO注射L-OHP导致荷瘤鼠WBC减少最少,

为15.43×103·μL-1,6.81 HALO注射L-OHP导致荷瘤鼠WBC减少最多,为14.19×103·μL-1（图3）.

2.3.2 荷瘤鼠体重 5组荷瘤鼠体重的总体差异有统计学意义（F等于41.48,P<0.001）,其中,10 HALO组和

对照组之间荷瘤鼠的体重差异无统计学意义（t等于0.548,

P>0.05）.4 HALO、16 HALO以及22 HALO组与对照组之间差异具有统计学意义（P<0.05）,但4 HALO和22 HALO组之间差异无统计学意义（P>0.05）,16 HALO与4 HALO和22 HALO之间差异有统计学意义（P<0.05）（表1）.余弦分析表明：不同时间点注射L-OHP后荷瘤鼠的体重具有昼夜节律性（F=3.49,P<0.05）,根据余弦拟合曲线显示：16.85 HALO注射L-OHP后荷瘤鼠体重值最大,为19.20 g,4.85 HALO注射L-OHP荷瘤鼠体重值最小,为18.85 g（图4）.

2.3.3 肛周肿胀率 5组荷瘤鼠肛周肿胀率差异有统计学意义（2等于16.996,P<0.01）.10 HALO组肛周肿胀率最高,为60.00%（9/15）；16 HALO组肛周肿胀率最低,为13.33%（2/15）.4 HALO和10 HALO组与16 HALO组之间荷瘤鼠的肛周肿胀率差异有统计学意义（P<

0.05）,但16 HALO和22 HALO之间荷瘤鼠肛周肿胀率差异无统计学意义（P>0.05）（表1）.证明在活动相注射L-OHP较休息相显著降低了荷瘤鼠的肛周肿胀率.

3.讨论

化疗是口腔鳞状细胞癌综合治疗的重要组成部分.铂类抗癌药物是目前治疗口腔癌最常用和最有效的药物之一,目前在临床上用于口腔鳞状细胞癌的化疗方案几乎全部含有铂类抗癌药物[7].L-OHP是

近年来研制出的第三代铂类抗癌药物,含有一个1,2二氨环己烷基团（DACH）,L-OHP活化后DACH环和

铂与癌细胞的DNA结合成铂-DNA复合体,形成链内及链间交联,从而阻止DNA的复制和转录,导致细胞周期非特异性死亡[8].目前研究证明：人体正常细

胞和肿瘤细胞的增殖、DNA合成水平有明显的昼夜时间节律,增殖和DNA合成越活跃的细胞对化疗药物越敏感,由于肿瘤细胞DNA合成和增殖的时间节律变化与人体正常细胞（骨髓、消化道黏膜上皮等）之间一般存在8～12 h时差,这就为不同时间应用化疗药物既能最大杀伤癌细胞,同时又尽量减少对正常细胞的损伤提供了基础[4-6]. 现已发现有30多种细胞物具有时辰化疗的特点,目前许多动物实验和一些多医疗中心通过时辰治疗结肠癌、乳腺癌和肺癌等临床经验证实[4-6,9-10]：金属铂类抗癌药物在不同时间用药所产生的抗癌疗效和对机体的不良反应具有显著性差异.笔者前期的临床研究也证明：卡铂抗癌药物对口腔鳞状细胞癌患者在不同时间用药可达到减毒增效的目的[11].但

目前肿瘤的时辰化疗研究主要是集中在对药物近期疗效的观察,缺乏长期疗效,如生存率的比较观察.实验常是对铂类抗癌药物联合其他药物的联合化疗方案的总体结果观察,缺乏对铂类抗癌药物单一化疗作用的观察.另外,目前的肿瘤时辰治疗研究通常只是比较不同时间用药后疗效和不良反应的差异,没有对其是否具有昼夜生物节律性进行验证和分析.目前以余弦函数为模型发展起来的余弦分析是分析生物节律性资料的有效方法,它能排除其他生物因素的干扰,将需要研究的生物节律分离,并将其特征用余弦拟合曲线直观地表示出来[12].

在临床上L-OHP常和其他抗癌药物联合应用,本研究用单一L-OHP治疗,其目的是更好发现L-OHP治疗口腔鳞状细胞癌的昼夜时辰特点.本研究发现：在10 HALO时间给药荷瘤鼠的抑瘤率和生存时间显著低于其他给药时间,尽管4 HALO时间给药的抑瘤率与16和22 HALO时间给药的抑瘤率差异无统计学意义,但4 HALO时间给药并没有延长荷瘤鼠的生存时间,只有在16和22 HALO两个时间给药显著延长了荷瘤鼠的生存时间.同时余弦分析证明不同时间注射L-OHP后荷瘤鼠的平均生存时间具有昼夜节律性,根据拟合的余弦曲线可知,2.86 HALO时（休息

相早期）注射L-OHP荷瘤鼠生存时间最短,为12.02 d；14.88 HALO时（活动相早期）注射L-OHP荷瘤鼠生存时间最长,为20.75 d.

由于L-OHP的主要不良反应为骨髓抑制、消化道黏膜上皮损伤[8].本研究选择给药后小鼠的体重（反映体质状况）、WBC计数（反映骨髓抑制情况）和肛周肿胀（反映胃肠道毒性情况）来评价不良反应[8,13].本研究发现：在4、10、16和22 HALO 4个时间点用药7 d后荷瘤鼠的体重、WBC计数和肛周肿胀率差异均有统计学意义.10 HALO给药后小鼠体重最轻,16 HALO给药后小鼠体重最重,即证明在16 HALO用药对小鼠全身体质状况影响最小.余弦分析证明不同时间注射L-OHP后荷瘤鼠的体重有昼夜节律性,16.85 HALO（活动相中期）注射L-OHP对荷瘤鼠体重影响最小,即对全身体质状况影响最小；4.85 HALO（休息

相中期）注射L-OHP对荷瘤鼠体重影响最大,即对荷

瘤鼠全身体质状况影响最大.WBC计数结果也表明：

在10 HALO给药后小鼠WBC减少最多,16 HALO组WBC减少最少,即证明在16 HALO给药对小鼠骨髓抑制最轻.余弦分析证明不同时间注射L-OHP后荷瘤鼠的WBC具有昼夜节律性,18.80 HALO（活动相

中期）注射L-OHP导致荷瘤鼠WBC减少最少,即对骨髓抑制最小；6.81 HALO（休息相中期）注射L-OHP

导致荷瘤鼠WBC减少最多,即对骨髓抑制最大.肛周肿胀结果也表明：在10 HALO（休息相晚期）注射L-OHP后荷瘤鼠肛周肿胀率最高（60.00%）,证明对胃

肠道毒性作用最大,在16 HALO（活动相早期和中期的转化时期）给药肛周肿胀率最低（13.33%）,对胃肠道毒性作用最小.

目前越来越多的学者认为：化疗用药时间的合理安排与用药剂量具有同等重要的地位[14].本研究

表明：在昼夜不同时间用L-OHP静脉注射治疗口腔鳞状细胞癌其产生的疗效和不良反应差异有统计学意义,并且这种差异的波动具有24 h昼夜节律性,在16和22 HALO两个时间用L-OHP能显著延长口腔鳞状细胞癌小鼠的生存时间.总体来看：L-OHP在活动相早期的后段时间和中期的前段时间用药所获得的疗效最好,不良反应最小；而在休息相早期和中期给药,其疗效最差,不良反应最大.尽管鼠类是夜行动物,其休息相和活动相与人类相反,但目前研究证明：从鼠类的休息相和活动相所获得的实验结果可以外推到人的相应休息相和活动相[5-6].因此,对口腔鳞状细胞癌患者的化疗应考虑时间因素,以增效减毒、提高患者生存率和生存质量.

[参考文献]

[1] Kademani D, Bell RB, Schmidt BL, et al. Oral and maxillofacial

surgeons treating oral cancer： A preliminary report from the Ame-

rican Association of Oral and Maxillofacial Surgeons Task Force

on Oral Cancer[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2008, 66（10）：2151-

2157.

[2] Kademani D, Bell RB, Bagheri S, et al. Prognostic factors in in-

traoral squamous cell carcinoma： The influence of histologic grade

[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2005, 63（11）：1599-1605.

[3] Eiann EA, Lush E, Sephton SE. Circadian effects in cancer-

relevant psychoneuroendocrine and immune pathways[J]. Psycho- neuroendocrinology, 2010, 35（7）：963-976.

[4] Huang XL, Fu CJ, Bu RF. Role of circadian clocks in the deve-

lopment and therapeutics of cancer[J]. J Int Med Res, 2011, 39

（6）：2061-2066.

[5] Lévi F, Okyar A, Dulong S, et al. Circadian timing in cancer

treatments[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2010, 50：377-421.

[6] Lévi F. Chronotherapeutics： The relevance of timing in cancer

therapy[J]. Cancer Causes Control, 2006, 17（4）：611-621.

[7] 温玉明. 口腔颌面部肿瘤现写作技巧论与临床实践[M]. 北京： 人民

卫生出版社, 2004：651-657.

Wen Yuming. Oral and maxillofacial oncology—the contemporary

conceptions and clinical practice[M]. Beijing： People’s Medical

Publishing House, 2004：651-657.

[8] Kelland L. Broadening the clinical use of platinum drug-based

chemotherapy with new analogues. Satraplatin and picoplatin[J].

Expert Opin Investig Drugs, 2007, 16（7）：1009-1021.

[9] Lévi F, Zidani R, Misset JL. Randomised multicentre trial of chro-

notherapy with oxaliplatin, fluorouracil, and folinic acid in metas-

tatic colorectal cancer. International Organization for Cancer Chro-

notherapy[J]. Lancet, 1997, 350（9079）：681-686.

[10] Smolensky MH, Peppas NA. Chronobiology, drug delivery, and

chronotherapeutics[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2007, 59（9/10）：828-

851.

[11] 杨凯, 陈睿, 喻秀丽. 口腔癌时辰化疗[J]. 实用口腔医学杂志,

2005, 21（3）：389-391.

Yang Kai, Chen Rui, Yu Xiuli. Neoadjuvant chrono-chemotherapy

for the patients with oral squamous cell carcinoma[J]. J Pract Sto-

matol, 2005, 21（3）：389-391.

[12] Manoharan S, Baskar AA, Manivasagam T, et al. Circadian rhyth-

micity of plaa lipid peroxidation and antioxidants in oral squa-

mous cell carcinoma[J]. Singapore Med J, 2005, 46（4）：184-188.

[13] Wood PA, Du-Quiton J, You S, et al. Circadian clock coordinates

cancer cell cycle progression, thymidylate synthase, and 5-fluo-

rouracil therapeutic index[J]. Mol Cancer Ther, 2006, 5（8）：2023-

2033.

[14] Mormont MC, Levi F. Cancer chronotherapy： Principles, applica-

tions, and perspectives[J]. Cancer, 2003, 97（1）：155-169.

（本文编辑 杜冰）