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电极类有关学士学位论文,与光电化学竞争法检测生物素相关论文怎么写

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摘 要[HTSS]建立了光电化学系统竞争性检测生物素(Biotin)小分子浓度的方法.采用联吡啶钌[Tris(2,2′bipyridine)ruthenium,Rubpy)]作为标记物,以氧化锡纳米颗粒为电极,草酸盐为电子供体还原标记物.在470nm光激发下,联吡啶钌的外层电子吸收能量后由基态变为激发态,注入半导体氧化锡纳米颗粒电极的导带,形成光电流信号;草酸盐还原失去电子的联吡啶钌使其恢复初始状态,从而可以再次作为电子供体受激发产生光电流信号.在竞争性检测生物素(Biotin)浓度时,亲和素(**idin)吸附到氧化锡纳米颗粒电极表面作为识别元件,在浓度大于0.5g/L时能够达到最大的电极表面覆盖率.1μmol/LRubpybiotin与不同浓度Biotin组成的混合溶液与电极表面的**idin发生亲和反应,光激发后检测光电流大小;当溶液中Biotin的浓度增加时,致使与电极表面**idin结合的Rubpybiotin量减少,在光照射下光电流信号降低.这一竞争性光电检测方法检测Biotin时,检出限为8μg/L.本方法可进一步扩展,应用于有机化合物的竞争性免疫检测.

1引言

小分子普遍存在于人类生命活动以及所处的环境中.环境中多种持久性有机污染物也是有机小分子化合物,如多环芳香烃、氯代二苯并二恶英、多氯二苯并呋喃以及多氯联苯等.在诸多常用的检测小分子化合物的分析方法中,基于抗体识别的免疫检测方法在速度、通量和成本方面具有显著的优势.免疫检测小分子时,通常会采用竞争性检测的方式,即将待检测物标记后与其抗体结合产生可检测的信号;当加入未标记的待检测物时,与标记的待检测物竞争有限的抗体结合位点,导致信号下降[1].目前多种标记物和相关的检测方法与仪器已被开发应用,如放射性同位素、荧光染料、酶、氧化还原分子等.

目前量子产率最高的光电化学电池采用纳米TiO2颗粒膜组装在导电玻璃上,并利用表面吸附的钌吡啶化合物使之敏化[2],Kalyanasundaram等[3]对其它宽带隙半导体电极和敏化剂也进行了研究.使用敏化剂作为标记分子可以进行生物分子亲和反应的检测,并且光电化学检测方法理论上应该具有很高的灵敏度;因为在这种方法的激发信号(光)和检测信号(电流)不会产生相互干扰[4].利用Cd量子点(QuantumDots)[5]和纳米管[6,

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7]进行光电化学传感已有报道;Pandey等[8]利用DNA嵌入染料蒽醌作为指示剂光电化学检测溶液中的DNA,该方法中光激发的蒽醌在溶液中被电子供体还原,利用修饰的石墨碳原子电极可以检测氧化还原电位的变化.利用蒽醌的光电化学性质也可研究固定于金电极上的双链DNA的电荷传输性质,并可以用于疾病的单核苷酸多态性(SNP)分型[9].

半导体纳米颗粒电极较其它电极在光电化学检测中具有明显优势,可以显著提高检测灵敏度,本研究组在检测溶液中的DNA研究中已经证明[10].除利用半导体纳米颗粒电极检测DNA[11,12]外,还可利用纳米颗粒电极非标记检测了多巴胺(Dopamine)[13]和ATP[14]的浓度.关于光电化学检测生物结合反应已有报道,尤其值得注意的是抗体/抗原的结合反应的光电化学检测[15,16].


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联吡啶钌作为标记物已广泛用于电化学发光检测免疫反应[17,18],可利用联吡啶钌合吩嗪(Ru(bpy)2dppz,dppz等于dipyrido[3,2a:2′,3′c]phenazine)与dsDNA具有高亲和性(K等于106-107L/mol)[19]的特点检测金电极表面固定的双链DNA[20,21].Zhang等[14]采用纳米颗粒电极和Ru(bpy)2dppz检测了癌细胞中ATP的浓度.

本研究组曾采用染料敏化的光电化学系统定量检测溶液中的DNA[10],该检测系统包括光电化学标记物Ru(bpy)2dppz,电子供体草酸盐和电极材料氧化锡纳米颗粒.由于该分析系统具有许多高量子产率光电化学太阳能电池的优点,所以在检测溶液中的DNA时,灵敏度比导体电极、金电极和碳电极有显著改善.本研究采用光电化学方法竞争性检测Biotin,Rubpybiotin复合物在此竞争性检测中作为光电化学标记分子;当各种浓度的Biotin(待检测物)与1μmol/LRubpybiotin混合溶液与电极表面的**idin反应后,标记分子受激发所产生的光电流会随Biotin浓度的增加而减小.本方法对Biotin的检出限为8μg/L.本研究为采用光电化学方法竞争性检测小分子的浓度提供了参考.

2实验部分

2.1仪器与试剂

双(联吡啶)4′****4羰基吡啶钌N琥珀酰亚胺酯双六氟磷酸酯(Rutheniumbis(2,2′bipyridine)(4methyl4′carboxyl2,2′bipyridine)NHSester(RuNHS),美国Fluka公司);**idin和Biotin(美国Sigma公司);Succinimidyl6(biotinamido)hexanoate(biotinLCNHS,美国Pierce公司).WLTNSI090铟锡氧化物镀膜玻璃(涂层(96±4)nm,片电阻(18±2)Ω),深圳伟光股份有限公司).

2.2实验步骤

2.2.1Rubpy标记avidin和biotinRubpy标记**idin按文献[22]方法进行.Rubpybiotin(图1)的合成:向溶于二****甲酰胺(Dimethylformamide,DMF)的RuNHS中加入10倍过量的乙二胺,冰浴中反应1h;在减压情况下,去除未反应的乙二胺和DMF;将所得固体溶解在丙酮中,加入****沉淀;沉淀所得固体和biotinLCNHS以摩尔比2∶1溶解在DMF中,室温反应3h,SephadexG25柱分离产物.产物通过NMR,UVVis吸收和循环伏安法表征.[TS(]图1Rubpybiotin复合物的结构Fig.1Structureoftris(2,2′bipyridine)ruthenium(Rubpy)biotinconjugate[HT5][TS)]

2.2.2Biotin和**idin的结合反应氧化锡电极按文献[22]方法制备.氧化锡电极吸附**idin的方法是以25μL**idin蛋白溶液覆盖0.5cm2电极表面,静置30min;以20mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.2)冲洗后,用1%牛血清白蛋白封闭电极,以减少非特异性结合.进行Biotin和**idin之间的结合反应时,将25μLBiotin或Rubpybiotin混合液覆盖在**idin吸附的电极上,并在无外力混合情况下室温反应1h;冲洗后,在电解液中测定光电流.

2.2.3光电流测定光电流测定用CHI800型电化学分析仪,Pt作为对电极,Ag/AgCl作为参比电极,电极间所加偏压为+0.3V;激发光源来自蓝色发光二极管(深圳Lamp公司),照明面积为0.2cm2.在进行光谱测量时,500W的氙灯和光栅用于产生单色可变波长的光,用于激发.

3结果与讨论

3.1检测条件的优化

本研究以Biotin/**idin为模式系统,研究光电化学方法检测小分子的可行性.Biotin是一种水溶性维生素(244Da).**idin是蛋清中存在的糖蛋白(66kDa).**idin和Biotin的亲和性非常高,解离常数为1015mol/L.**idinbiotin系统已被广泛用于免疫组化、酶联免疫吸附分析以及分子生物学测定.本实验将**idin固定在氧化锡电极表面,使之捕获溶液中的Biotin或Rubiotin,通过测量Ru标记物产生的光电流测量溶液中Biotin的浓度(图2).

**idin含有碱性氨基酸如赖氨酸和精氨酸,等电点约为10,易于吸附到带负电荷的电极表面.实验表明,**idin对氧化锡电极的吸附性很强,所以采用吸附法在电极上固定**idin.将电极在各种浓度的**idinRu中浸泡2h,冲洗后,通过测量光电流评估蛋白吸附效果.由图3可见,当**idinRu浓度从0增加至1g/L时,光电流先随溶液中**idinRu浓度增加而增大;**idinRu浓度大于0.5g/L时,光电流达到平台期,证明在这种浓度下蛋白吸附趋于饱和.表面固定的**idinRu保持相对稳定,[TS(]图3吸附在氧化锡电极上的**idinRu产生的稳态光电流与**idinRu浓度之间的关系,小图:**idinRu吸附的氧化锡电极浸泡在Ph7.5,20mmol/L磷酸盐缓冲液中(a)0h(b)2h后的光电流


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Fig.3SteadystatephotocurrentofRulabeledavidinadsorbedonSnO2electrodeasafunctionoftheproteinconcentration.Inset:PhotocurrentofRulabeledavidincoatedSnO2electrodeaftersoakingin20mmol/Lphosphatebuffer,pH7.5for(a)0h(b)2h

光电流测定采用pH5.5,10mmol/L草酸钠/100mmol/L磷酸钠溶液,以470nm光激发.

为了平衡光电信号和灵敏度的要求,标记物剂浓度选择1μmol/L用于竞争性检测.对照实验采用吸附牛血清白蛋白(BSA)的电极与1μmol/LRubpybiotin反应.它的光电流仅为吸附**idin电极的1/3,并和未与Rubpybiotin的BSA电极产生的光电流相同,对比证明吸附**idin电极产生的光电流响应是由于**idin和Botin之间的特异性相互作用.电极吸附**idin反应的Rubpybiotin受激发产生光电流时,光电流随激发光波长的变化情况见图5.光电流的谱形类似自由标记分子(插图)的吸收光谱,在470nm处达到峰值.**idin/氧化锡电极本身并未表现出波长依存性,证明光激发所产生的光电流是由金属Ru络合物引起的.

3.2检测溶液中biotin的浓度

确定了标记物Rubpybiotin的浓度后,在吸附了avidin的氧化锡电极上竞争性检

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